专利摘要

本发明公开了含硫醚及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物，制备方法为以4‑溴‑1,8萘酐为起始原料，与巯基水杨酸反应得到含有硫醚的4‑巯基水杨酸‑1,8‑萘酐，再与胆甾醇在DCC、DMAP作催化剂条件下经酯化反应得到含有硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺结构母体，最后该母体与不同的脂肪胺反应得到目标化合物；所述的脂肪胺选自N,N‑二甲基乙二胺、N,N‑二甲基丙二胺、N，N‑二乙基乙二胺、N‑氨乙基哌嗪、正丁胺。本发明提供上述含胆甾醇的萘酰亚胺类衍生物在抑制癌细胞药物中具有很好的应用前景。

权利要求

1.含硫醚及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物，结构通式如下：

2.如权利要求1所述含硫醚及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，以4-溴-1,8萘酐为起始原料，与巯基水杨酸反应得到含有硫醚的4-巯基水杨酸-1,8-萘酐，再与胆甾醇在DCC、DMAP作催化剂条件下经酯化反应得到含有硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺结构母体，最后该母体与不同的脂肪胺反应得到目标化合物；

所述的脂肪胺选自N,N-二甲基乙二胺、N,N-二甲基丙二胺、N，N-二乙基乙二胺、N-氨乙基哌嗪、正丁胺。

3.如权利要求1所述含硫醚及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物在制备抑制癌细胞药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述癌细胞选自人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549。

说明书

技术领域

本发明涉及生物有机合成领域中的一类含硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物的合成及应用。

背景技术

由于基因突变而导致正常细胞在形态与功能等方面向肿瘤细胞的转变。因此从基因的角度来开展肿瘤的预防与治疗具有重要意义。其中，萘酰亚胺类化合物因其具有平面刚性结构、具有诸多可修饰的位点以及较强的与DNA结合能力，是被人们广泛研究的DNA嵌入剂母体之一。其中以萘酰亚胺为母体进行修饰得到的两个先导药物安奈菲特和米托萘胺目前已经进入临床Ⅱ期实验阶段。胆甾醇又称胆固醇，是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。研究发现，不同甾醇结构进行修饰后表现出强的抗肿瘤活性。Gan课题组以胆甾醇为原料，通过化学方法合成3,5-二羟基-6-甲酰基-B-降胆甾烷，并进一步脱乙酰基得到两个胆甾醇类衍生物，在肿瘤细胞抑制增长试验中，对人卵巢癌、肝癌等肿瘤细胞株具有明显的抑制作用。硫醚用途较广，常用作医药、农药领域。Zhang课题组合成噻二唑硫醚衍生物在抑制肝癌细胞时具有明显的抑制能力。

发明内容

本发明提供一类含硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物的合成及应用。首先萘酰亚胺母体引入巯基水杨酸，然后与胆甾醇酯化反应得到含萘酰亚胺及胆甾醇酯的结构，最后引入不同的脂肪胺，得到具有抗癌效果的新药。

本发明所述的含硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物，以巯基水杨酸为连接物，与萘酰亚胺母体反应得到含硫醚化合物。将上述中间体与胆甾醇通过DCC法发生酯化反应生成含萘酰亚胺硫醚的胆甾醇酯结构母体。将上述母体与不同的脂肪胺反应得到具有抗癌活性的目标化合物。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：含硫醚及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物，其化学分子结构通式如下：

通式中：

R选自N位取代的N,N-二甲基乙二胺基、N,N-二甲基丙二胺基、N，N-二乙基乙二胺基、N-氨乙基哌嗪基、正丁胺基。

本发明提供上述含胆甾醇的萘酰亚胺类衍生物的制备方法，以4-溴-1,8萘酐为起始原料，与巯基水杨酸反应得到含有硫醚的4-巯基水杨酸-1,8-萘酐，再与胆甾醇在DCC、DMAP作催化剂条件下经酯化反应得到含有硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺结构母体，最后该母体与不同的脂肪胺反应得到目标化合物。

所述的脂肪胺选自N,N-二甲基乙二胺、N,N-二甲基丙二胺、N，N-二乙基乙二胺、N-氨乙基哌嗪、正丁胺。

上述的含硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物的合成路线如下：

本发明提供上述含胆甾醇的萘酰亚胺类衍生物在抑制癌细胞药物中的应用。所述的癌细胞株为HepG2(人肝癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞胞)、A549(肺癌细胞)，正常对照细胞株是RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)。

将所合成的含硫醚以及胆甾醇酯的萘酰亚胺衍生物采用MTT比色法针对Hela(人宫颈癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)和A549(肺癌细胞)三种肿瘤细胞进行体外抗肿瘤活性测试。

用上述合成的含胆甾醇的萘酰亚胺类衍生物用MTT比色法对HepG2(人肝癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)、A549(肺癌细胞)和RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)进行体外抑制肿瘤细胞生长的效果。

具体操作方法为将三种肿瘤细胞传代培养，经细胞计数后以5×103个细胞/孔接种于96孔板内，培养24h后加入DMSO溶解的药物。设置成五个浓度梯度以及空白对照，同时设置6个平行对照。加药完毕后将孔板放置在37℃、5％CO2条件下培养24h，后每孔加入25μL的MTT(溶解于PBS缓冲液中)作用4h后，移液枪小心取出上清液，注意不要吸到蓝紫色结晶，加入DMSO溶解孔中的结晶，放置在摇床上10min后用酶标仪测量在490nm处的OD值，根据OD值计算出抑制率，然后利用寇式改良法计算被测物对癌细胞生长的IC50值。

本发明所述的含三取代三聚氯氰的萘酰亚胺类衍生物加入DNA之后，DNA溶液的粘度随着化合物浓度而增加改变。

DNA分子解旋后导致溶液粘度增大。因此，单纯的DNA溶液与加入化合物之后混合溶液粘度的变化可以表明出DNA解旋程度。用Tris-HCl缓冲液将CT-DNA稀释到100μM，用乌氏粘度计在25℃中进行粘度测试。每次移取10mL稀释好的CT-DNA溶液加入乌氏粘度计，用秒表记录溶液滴下的时间，之后依照不同的R值滴加1×10-3mol/L的化合物DMSO溶液，记录不同的R值加入之后溶液滴落的时间，重复三次，取均值。以(η/η0)1/3对于R值作图，其中η0为CT-DNA溶液的相对运动粘度，η为加入不同R值化合物后溶液的相对运动粘度。R值分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30。

附图说明

图1为化合物D1-D4对DNA相对粘度的影响曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

N-(N,N-二甲基乙二胺基)-4-巯基水杨酸胆甾醇酯-1,8-萘酰亚胺(目标产物D1)的合成：

(1)4-巯基水杨酸-1,8萘酐的合成：

取一个干燥洁净的50mL两口瓶，称取2g的4-溴-1,8萘酐以及2.8g巯基水杨酸，加入两口烧瓶中，再加入15mL二甲基甲酰胺(DMF)，将两口瓶放置于磁力搅拌器上，调整转速，慢速搅拌直至反应物基本溶解。之后将烧瓶转移至油浴锅中，调整转速，调节温度在100℃加热3h，TLC跟踪至反应结束。当反应结束后，停止加热搅拌，冷却至室温后，静置等待溶液中产物沉淀。待沉淀基本结束后，减压抽滤，数次洗涤后干燥得到黄色晶体1.96g，产率78.09％。

(2)4-巯基水杨酸胆甾醇酯-1,8-萘酐的合成：

取一个干燥的100mL两口烧瓶，称取2g的4-巯基水杨酸-1,8萘酐的粗产物、2.2g胆甾醇、1.76g二环己基碳二亚胺(DCC)以及0.348g的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，依次加入到两口烧瓶中，再加入干燥处理后的二氯甲烷30mL。无水氯化钙干燥，在室温条件下反应24h，TLC跟踪至反应结束。反应结束后，将溶剂蒸干。产物使用硅胶柱层析法进行分离提纯，洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇＝15:1，产率52.18％。

(3)N-(N,N-二甲基乙二胺基)-4-巯基水杨酸胆甾醇酯-1,8-萘酰亚胺(目标产物D1)的合成：

取一个干燥的50mL两口烧瓶，称取1g的4-巯基水杨酸胆甾醇酯-1,8-萘酐加入到两口烧瓶中，加15mL无水乙醇作为反应溶剂，搅拌至固体溶解，缓慢滴加0.34mL的N,N-二甲基乙二胺，该过程不断地搅拌。调整转速，回流温度恒温加热4h，TLC跟踪至反应结束。反应结束，冷却至室温，减压蒸馏，除去溶剂。使用硅胶柱层析法进行分离提纯，洗脱剂使用二氯甲烷:甲醇＝30:1的混合溶剂，得到黄色目标产物，产率61.33％。熔点：173.1℃。

+ESI MS(M+H)：C50H64N2O4S，计算值：788.4631，实测值：788.4668。

1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.64(t,J＝6.8Hz,2H),8.54(d,J＝7.6Hz,1H),8.03(d,J＝7.5Hz,1H),7.90(d,J＝7.6Hz,1H),7.74(t,J＝7.9Hz,1H),7.26(d,J＝3.8Hz,1H),7.22(dd,J＝9.6,4.6Hz,1H),7.19(d,J＝6.1Hz,1H),6.73(d,J＝7.9Hz,1H),5.43(t,J＝18.5Hz,1H),4.97–4.81(m,1H),4.36(t,J＝6.9Hz,2H),2.71(t,J＝6.9Hz,3H),2.62(s,1H),2.53–2.44(m,2H),2.38–2.31(m,3H),2.00(t,J＝16.7Hz,3H),1.91(d,J＝3.3Hz,1H),1.84(dd,J＝8.4,4.8Hz,1H),1.80–1.63(m,3H),1.61–1.54(m,2H),1.52–1.48(m,2H),1.46–1.26(m,6H),1.23–1.14(m,4H),1.13–1.05(m,4H),1.04–0.95(m,6H),0.92(d,J＝6.5Hz,3H),0.87(dd,J＝6.6,2.0Hz,6H).

13C NMR(126MHz,CDCl3)δ165.85(s),163.86(d,J＝15.4Hz),140.38(s),139.42(s),138.53(s),133.37(s),132.42(s),132.13(s),131.84(d,J＝7.5Hz),131.27(s),130.93(s),129.75(d,J＝11.3Hz),128.90(s),127.69(s),126.06(s),123.30(s),122.94(d,J＝4.2Hz),76.67(dd,J＝126.7,94.8Hz),60.36–55.39(m),53.42(s),50.01(s),45.44(s),42.32(s),39.62(d,J＝26.5Hz),38.27–34.34(m),31.89(d,J＝7.0Hz),29.43–27.16(m),21.73(d,J＝321.4,238.6,64.3Hz)。

实施例2

N-(N,N-二甲基丙二胺基)-4-巯基水杨酸胆甾醇酯-1,8-萘酰亚胺(目标产物D2)的合成：

除用N,N-二乙基丙二胺替代N,N-二甲基乙二胺之外，其它合成步骤同D1，得到目标化合物D2，黄色固体，产率51.18％。熔点：153.2℃～153.9℃。

+ESI MS(M+H):C51H66N2O4S，计算值：802.4793，实测值：802.4808。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.94(dd,J＝12.4,4.0Hz,1H),4.83(d,J＝7.6Hz,1H),4.32(dd,J＝7.4,1.9Hz,1H),4.18(d,J＝7.6Hz,1H),4.08–3.97(m,1H),3.64–3.43(m,2H),3.13–2.97(m,1H),1.81–1.51(m,2H),1.37–1.04(m,1H),0.73–0.44(m,1H),-1.00–-1.42(m,5H),-1.57–-1.77(m,3H),-1.79–-3.11(m,22H),-3.71(d,J＝3.2Hz,1H)。

13C NMR(126MHz,CDCl3)δ165.84(s),163.80(d,J＝15.2Hz),140.50(s),139.42(s),138.41(s),133.30(s),132.43(s),131.80(s),131.28(s),130.92(s),129.82(d,J＝9.5Hz),128.84(s),127.70(s),126.11(s),123.24(s),122.90(d,J＝16.3Hz),78.06–76.29(m),75.54(s),57.97–55.68(m),53.42(s),50.01(s),44.88(s),42.32(s),37.70(ddd,J＝152.2,120.7,38.2Hz),31.89(d,J＝7.0Hz),28.02(t,J＝23.8Hz),22.27(ddd,J＝482.4,256.1,117.8Hz),11.86(s).

实施例3

N-(N,N-二乙基乙二胺基)-4-巯基水杨酸胆甾醇酯-1,8-萘酰亚胺(目标产物D3)的合成：

除用N,N-二乙基乙二胺替代N,N-二甲基乙二胺之外，其它合成步骤同D1，得到目标化合物D3，黄色固体，产率55.18％。熔点：165.5℃～166.1℃。

+ESI MS(M+H):C52H68N2O4S，计算值：816.4933，实测值：816.4971。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69–8.59(m,2H),8.53(d,J＝7.6Hz,1H),8.03(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.88(d,J＝7.6Hz,1H),7.79–7.69(m,1H),7.28–7.15(m,3H),6.74(d,J＝7.6Hz,1H),5.46–5.27(m,2H),5.04–4.78(m,1H),4.37–4.23(m,2H),2.87–2.75(m,2H),2.67(q,J＝7.1Hz,4H),2.62–2.38(m,2H),2.38–2.12(m,1H),2.01(d,J＝12.5Hz,3H),1.85(ddd,J＝24.4,18.5,15.1Hz,3H),1.52(dddd,J＝45.6,41.2,25.8,10.7Hz,12H),1.32–0.80(m,32H),0.68(s,3H),-0.01(s,1H).

13C NMR(126MHz,CDCl3)δ165.85(s),163.79(d,J＝15.3Hz),140.46(s),140.05–139.87(m),138.91(d,J＝128.0Hz),133.27(s),133.22–132.74(m),132.44(s),132.04(dd,J＝58.4,24.7Hz),131.27(s),130.88(s),129.85(d,J＝9.2Hz),128.87(s),127.69(s),126.12(s),123.29(s),122.91(d,J＝12.1Hz),77.29(s),77.04(s),76.79(s),75.54(s),56.68(s),56.18(d,J＝6.2Hz),54.28(s),50.01(s),45.88(s),42.32(s),39.72(s),39.51(s),38.12(s),37.41(s),37.00(s),36.62(s),36.18(s),35.79(s),31.89(d,J＝6.8Hz),29.69(s),28.22(s),28.00(s),27.84(s),24.28(s),23.84(s),22.81(s),22.56(s),21.05(s),19.30(s),18.72(s),11.87(s).

实施例4

N-(N-氨乙基哌嗪基)-4-巯基水杨酸胆甾醇酯-1,8-萘酰亚胺(目标产物D4)的合成：

除用N-氨乙基哌嗪替代N,N-二甲基乙二胺之外，其它合成步骤同D1，得到目标化合物D4，黄色固体，产率59.11％。熔点：155.6℃～156.1℃。

+ESI MS(M+H):C52H67N3O4S，计算值：829.4905，实测值：829.4822。

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,5H),8.41(d,J＝98.1Hz,8H),8.04(s,6H),7.82(d,J＝53.6Hz,8H),7.26(s,33H),6.77(s,3H),5.37(d,J＝26.2Hz,24H),4.99(d,J＝64.2Hz,8H),4.41–4.36(m,3H),3.69(s,4H),3.51(s,3H),3.36–3.31(m,2H),2.76(s,2H),2.62(s,3H),2.46(s,6H),2.31(s,3H),2.22(s,4H),2.01(s,30H),1.88(s,8H),1.50(s,12H),1.43(s,13H),1.19(d,J＝52.1Hz,175H),0.89(d,J＝14.5Hz,62H),0.87(dd,J＝73.4,58.9Hz,147H),0.82(t,J＝45.2Hz,105H),0.68(s,25H),-0.01(s,10H).

13C NMR(126MHz,CDCl3)δ165.85(s),163.77(d,J＝15.6Hz),140.47(s),139.42(s),138.35(s),133.22(s),133.09–132.66(m),132.66–132.48(m),132.02(dd,J＝59.8,26.2Hz),131.28(s),130.85(s),129.90(d,J＝9.7Hz),128.85(s),127.68(s),126.13(s),123.30(s),122.91(d,J＝11.4Hz),77.29(s),77.04(s),76.78(s),75.54(s),56.68(s),56.16(s),50.01(s),49.77(s),47.62(s),42.32(s),39.73(s),39.52(s),38.11(s),37.94(s),37.00(s),36.62(s),36.19(s),35.79(s),31.89(d,J＝6.9Hz),29.69(s),28.22(s),28.01(s),27.83(s),24.28(s),23.84(s),22.81(s),22.56(s),21.05(s),19.29(s),18.72(s),12.11(s),11.87(s).

应用例1：体外抗肿瘤活性抑制实验

选用Hela(人宫颈癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)和A549(人肺癌细胞)三种细胞对目标化合物D1-D4进行测试，采用MTT法计算相应的IC50值。

表1化合物D1-D4对Hela，MCF-7，A549细胞的IC50值

Tab.1.The values of IC50of compounds D1-D4 against Hela,MCF-7 and A549

由上表可见，D系列化合物对所选取的三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，且不同化合物针对不同肿瘤细胞具有不同的抑制作用。总体上，四个化合物具有较为明显的抑制能力。在针对宫颈癌细胞的抑制效果上，化合物D3具有最强的抑制能力，其半数抑制浓度13.36μM，化合物D4具有仅次于D3的抑制能力。在针对人乳腺癌细胞的抑制能力上，化合物D4表现突出(IC50＝19.58μM)，具有很强的抑制能力。在对肺癌细胞的抑制能力上，化合物D4在该系列化合物中具有最好的效果。D1和D2在抑制该细胞的能力上表现一般。综合以上来看，化合物D3和D4在抑制以上三种肿瘤细胞时都具有较好的抑制能力，具有一定的药效。

应用例2

用Tris-HCl缓冲液将CT-DNA稀释到100μM，用乌氏粘度计在25℃中进行粘度测试。每次移取10mL稀释好的CT-DNA溶液加入乌氏粘度计，用秒表记录溶液滴下的时间，之后依照不同的R值滴加1×10-3mol/L的化合物DMSO溶液，记录不同的R值加入之后溶液滴落的时间，重复三次，取均值。以(η/η0)1/3对于R值作图，其中η0为CT-DNA溶液的相对运动粘度，η为加入不同R值化合物后溶液的相对运动粘度。R值分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30。

图1为25℃时加入D1-D4对DNA相对粘度的变化图。由图可见，D1-D4的加入均导致DNA粘度变大，且随着化合物浓度的增大，DNA粘度增大趋势增强。这表明该系列化合物可以嵌入到DNA的碱基对之间，引起DNA双链解旋，使得溶液粘度的增大。

含硫醚及胆甾醇酯的萘酰亚胺类衍生物合成和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。