专利摘要
本发明公开了一种海参皂苷CladolosideA的提取方法，属于生物分离技术领域。本发明将仿刺参体壁通过乙醇水溶液进行浸提，浓缩液采用AB‑8大孔树脂进行富集分离，收集浸膏，得海参皂苷粗提物。利用正反向硅胶柱进行分离纯化，得到纯品，通过核磁共振波谱进行结构分析鉴定，确定为化合物CladolosideA。本发明提取方法简便、快捷、高效、绿色，能得到纯度较高的海参皂苷CladolosideA，且该化合物从仿刺参首次提取，为进一步探索海参皂苷CladolosideA的药理活性奠定了基础，对深入研究仿刺参中海参皂苷的生理合成具有科学意义。
权利要求
1.一种海参皂苷Cladoloside A的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取新鲜仿刺参经解剖去内脏后粉碎，得到仿刺参糜肉，加入80％的乙醇水溶液进行回流提取，提取3次，提取液趁热过滤，收集滤液进行浓缩回收，得浓缩浸膏为总提取物；
(2)将步骤(1)中得到的总提取物，均匀分散在水中，过大孔树脂柱进行梯度洗脱，洗脱顺序为水、80％乙醇，经薄层色谱分析，收集80％乙醇的洗脱液；
(3)将步骤(2)中得到的80％乙醇洗脱液回收，进行浓缩，得海参总皂苷提取物；
(4)将步骤(3)中得到的海参总皂苷提取物通过正向硅胶柱，用不同比例的氯仿、甲醇和水作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，氯仿：甲醇：水的体积比依次为10:1:0.1、9:1:0.1、4.5:1:0.1、4:1:0.1、3:1:0.1、2:1:0.1、1:1:0.1；洗脱液经过薄层色谱分析，选取含量大的部分进一步通过两次反向硅胶柱层析进行分离纯化，两次反向硅胶柱层析的洗脱溶剂依次分别为体积比为5:1的甲醇和水以及体积比为1:1的甲醇和水；浓缩后得到海参皂苷Cladoloside A；所述正向硅胶柱中填料的粒度为200-300目，反向硅胶柱中填料的粒度为50μm。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中仿刺参糜肉与80％的乙醇水溶液的质量比为1：7，提取的时间分别为2小时、1.5小时和0.5小时，滤液浓缩的方式为真空旋转浓缩，浓缩的温度为40℃。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中大孔树脂层析柱中的大孔树脂填料的粒度为0.3-1.25mm。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中总提取物与大孔树脂的质量比为1：7-1：8。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中大孔树脂洗脱中的洗脱溶剂为大孔树脂质量的6-7倍，洗脱流速为每小时1个柱床体积。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中薄层色谱展开剂为氯仿、甲醇和乙酸乙酯，其中氯仿：甲醇：乙酸乙酯的体积为9：3：2；步骤(4)中薄层色谱展开剂为氯仿、甲醇和水，其中氯仿：甲醇：水的体积为4：1：0.1。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中浓缩的方式均为真空旋转浓缩，浓缩的温度均为40℃。
说明书
技术领域
本发明涉及一种海参皂苷Cladoloside A的提取方法，属于生物分离技术领域。
背景技术
海参皂苷是仿刺参的主要活性成分，在仿刺参的体壁、肌肉、肠道、呼吸树、体腔液等任何部位都有分布，但各个部分海参皂苷的种类和含量不同。仿刺参体壁中海参皂苷含量较高，具有抗真菌、抗肿瘤、抗凝血等活性，药用和保健价值被越来越多的人所认可。因此，海参皂苷的药理活性受到广泛关注。目前，国内外学者发现并确定结构的海参皂苷有100多种，其苷元多数具有羊毛甾醇的基本骨架，但未发现从仿刺参体壁提取海参皂苷Cladoloside A的相关报道。
目前，国内对海参总皂苷的提取比较多，而对海参皂苷单体的提取相对比较少，技术难度较高，不易得到纯度较高的单体化合物，很难进行进一步的药理活性研究。本发明提供一种从仿刺参体壁分离得到海参皂苷Cladoloside A的方法。
发明内容
本发明提供了一种海参皂苷Cladoloside A的提取方法，能够简单、高效、快速提纯海参皂苷Cladoloside A，包括如下步骤：
(1)选取新鲜仿刺参经解剖去内脏后粉碎，得到仿刺参糜肉，加入80％的乙醇水溶液进行回流提取，提取3次，提取液趁热过滤，收集滤液进行浓缩回收，得浓缩浸膏为总提取物；
(2)将步骤(1)中得到的总提取物，均匀分散在水中，过大孔树脂柱进行梯度洗脱，洗脱顺序为水，80％乙醇，经薄层色谱分析，收集80％乙醇的洗脱液；
(3)将步骤(2)中得到的80％乙醇洗脱液回收，进行浓缩，得海参总皂苷提取物；
(4)将步骤(3)中得到的海参总皂苷提取物通过正向硅胶柱，用不同比例的氯仿、甲醇和水做为洗脱溶剂进行梯度洗脱，洗脱液经过薄层色谱分析，选取含量大的部分进一步通过两次反向硅胶柱层析进行分离纯化，浓缩后最终得到无色结晶性粉末，该粉末即为海参皂苷Cladoloside A。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中仿刺参糜肉与80％乙醇水溶液的质量比为1：7，提取的时间分别为2小时、1.5小时和0.5小时，滤液浓缩的方式为真空旋转浓缩，浓缩的温度为40℃。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中大孔树脂层析柱中的大孔树脂填料的粒度为0.3-1.25mm。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中总提取物与大孔树脂的质量比为1：7-1：8。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中大孔树脂洗脱中的洗脱溶剂为大孔树脂质量的6-7倍，洗脱流速为每小时1个柱床体积。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中薄层色谱展开剂为氯仿、甲醇和乙酸乙酯，体积比为9：3：2；步骤(4)中薄层色谱展开剂为氯仿、甲醇和水，体积比为4：1：0.1。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)和步骤(4)中浓缩的方式均为真空旋转浓缩，浓缩的温度均为40℃。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中氯仿：甲醇：水的体积比依次为10:1:0.1、9:1:0.1、4.5:1:0.1、4:1:0.1、3:1:0.1、2:1:0.1、1:1:0.1。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中两次反向硅胶柱层析的洗脱溶剂依次分别为体积比为5:1的甲醇和水以及体积比为1:1的甲醇和水。
发明有益效果
本发明提供了海参皂苷Cladoloside A的提取方法，本方法通过80％乙醇水溶液回流，大孔树脂富集和柱层析分离纯化得到了高纯度的单体海参皂苷，采用乙醇和水作为溶剂，避免了使用对环境有污染的乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂，且乙醇在生产过程进行回收循环使用，极大的降低了生产成本。因此，本方法提供了一步富集和一步纯化得到的海参皂苷Cladoloside A纯度在90％以上的工艺方法，提取工艺简化，操作步骤缩短，保证海参皂苷Cladoloside A不因纯化时间太长而大量损失，而且成本较低，污染少，绿色提取，适合放大进行工业化生产，具有分离工艺简单、快速、经济、高效、绿色的特点，为进一步探索海参皂苷Cladoloside A的药理活性奠定了基础。而且该化合物从仿刺参首次提取，为进一步研究仿刺参中海参皂苷的生理合成具有科学意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提取的化合物海参皂苷Cladoloside A的液相色谱分析。
图2为本发明实施例1提取的化合物海参皂苷Cladoloside A的
图3为本发明实施例1提取的化合物海参皂苷Cladoloside A的
图4为本发明实施例1提取的化合物海参皂苷Cladoloside A的DEPT谱。
图5为本发明实施例1提取的化合物海参皂苷Cladoloside A结构式。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
本发明所述海参皂苷Cladoloside A通过以下提取方法提取：
(1)原材料选取与处理
选取新鲜仿刺参经解剖去内脏后，经高速组织捣碎机粉碎，约7公斤糜肉，向其中加入与仿刺参糜肉7倍质量的80％的乙醇水溶液分批次进行回流提取，提取3次，提取时间分别为2小时、1.5小时和0.5小时，趁热过滤，收集滤液，在40℃条件下进行真空旋转浓缩回收，得浓缩浸膏为总提取物。
(2)总提取物的处理
将步骤(1)中得到的总提取物，均匀分散在水中，加入到装有AB-8大孔树脂的层析柱中，该层析柱是用AB-8大孔树脂填料填充(粒度：0.3-1.25mm，天津市光复精细化工研究所)，层析柱长120cm，直径为10cm，加入树脂量为提取物质量的7-8倍，先用水为溶剂洗脱掉提取液中的糖类和无机盐类及一些杂质，再以80％乙醇水溶液为溶剂洗脱富集海参总皂苷洗脱液，洗脱溶剂为大孔树脂质量的6-7倍，洗脱流速控制每小时1个柱床体积，经薄层色谱分析(展开剂体积比为：氯仿：甲醇：乙酸乙酯为9：3：2)，收集80％乙醇洗脱液，在40℃下用旋转蒸发仪真空旋转浓缩，得海参总皂苷提取物。
(3)分离
将步骤(2)中得到的海参总皂苷提取物，经正相硅胶(粒度：200-300目，青岛海洋化工厂)柱层析分离，以不同体积比例氯仿、甲醇和水(10:1:0.1，9:1:0.1，4.5:1:0.1，4:1:0.1，3:1:0.1，2:1:0.1，1:1:0.1)进行梯度分离，分成A-G七部分，采用展开剂体积比为氯仿-甲醇-水(4：1：0.1)进行薄层色谱检测，发现F部分海参皂苷含量较高，因此对F部分进行进一步纯化。
(4)纯化
将步骤(3)中得到的提取物先用ODS反向硅胶(粒度：50μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)柱层析进行纯化，洗脱溶剂体积比为5:1的甲醇和水，再用体积比为1:1的甲醇和水进行二次纯化，40℃真空旋转浓缩，得到无色结晶性粉末。
取粉末1mg溶于1ml甲醇中，使用HPLC-DVD进行液相色谱分析，确定纯度为90％的单体化合物。以下是色谱分析条件：
采用Zorbax SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，紫外检测波长：205nm，流速：1ml/min，进样量：10ul，流动相为乙腈和水，梯度洗脱，洗脱顺序如表所示：
该单体化合物液相色谱如图1所示。
(6)结构鉴定
取约10mg粉末溶于氘代二甲亚砜，使用Bruker 400M核磁共振谱仪(AVANCEⅢ400MHz)进行结构分析，
一种海参皂苷CladolosideA的提取方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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