专利摘要

本发明属于益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法；本发明对扩大培养过程中的温度、pH和培养基进行优化控制，制备的聚合电解质微胶囊具有蜂窝状的内核和壳状的外层结构，并结合干燥、真空包装保存。生产的地衣芽胞杆菌微胶囊在模拟胃液中，地衣芽孢杆菌具有高存活率、高环境耐受性的优点，该产品不仅可应用于保健食品领域，也可应用于医药领域。本发明的菌株为益生菌，载体材料为自然界中的天然多糖类高分子，绿色、安全、环保。

权利要求

1.一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将地衣芽孢杆菌菌液接种于pH＝6.4-7.5的液体培养基中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养10-18h，进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将所述活化种子液按2-7％的接种量接种于装有pH＝6.4-7.5的新鲜液体培养基的锥形瓶中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养2-6h，得到地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将所述地衣芽孢杆菌培养物于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，获得沉淀菌体；

按体积比1：4-8向所述沉淀菌体中加入无菌水、振荡混均，再于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，反复洗涤2-3次，最后用无菌水悬浮菌体，得到活菌数≥10⁹cfu/mL的地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将所述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经无菌处理的聚阴离子电解质溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液，在所述内水相菌体悬浮液中聚阴离子电解质浓度为0.01-0.04g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经无菌处理的浓度为0.04-0.1g/mL的小分子溶液作为外水相A液备用；配制经无菌处理的浓度为0.005-0.03g/mL的聚阳离子电解质溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊的制备：将1-5mL的内水相菌体悬浮液以450-850μL·min^-1的流速注入到15-60mL外水相A液中，在200-500rpm转速下保持外水相的低速流动，经室温固化反应5-35min后，收集载菌微胶囊，用无菌水洗涤后缓慢加入到15-60mL外水相B液中，在200-500rpm转速下保持外水相的低速流动，室温包衣反应5-35min后，收集产物并用无菌水均匀洗涤，得到耐胃酸型地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：将所述耐胃酸型地衣芽孢杆菌湿微胶囊低温真空干燥后，在无菌条件下进行真空包装，即得到干燥的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊。

2.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：

步骤(7)中所述的低温真空干燥为45℃以下的任何一种干燥方式。

3.根据权利要求1所述地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的地衣芽孢杆菌菌株为野生型地衣芽胞杆菌、基因工程型地衣芽胞杆菌中的一种或两种。

4.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的液体培养基为MRS液体培养基、LB液体培养基或大豆豆粕上清液体培养基。

5.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(4)和步 骤(5)中所述的无菌处理方法为过滤除菌或高温灭菌。

6.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的聚阴离子电解质溶液为海藻酸钠溶液；步骤(5)中所述的聚阳离子电解质溶液为氯化壳聚糖溶液。

7.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的小分子溶液为氯化钙溶液、氯化钡溶液或氯化铁溶液。

8.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(6)中所述的无菌水为蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。

说明书

技术领域

本发明涉及益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法。

背景技术

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种芽孢杆菌科细菌，为革兰氏阳性杆菌。地衣芽孢杆菌能够调节肠道内微生物菌群之间、微生物菌群与宿主之间的微生态平衡。肠道微生态功能紊乱所导致的疾病，如细菌或病毒性腹泻、急慢性肠炎，可以通过服用地衣芽孢杆菌制剂来调整肠道菌群失调，达到治疗并恢复肠道功能的目的；同时，地衣芽孢杆菌可促使机体产生抗菌活性物质，以杀灭致病菌。此外，地衣芽孢杆菌在机体内能产生抗活性物质，具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。故地衣芽胞杆菌在临床医学上属于安全性的有益微生物，在保健食品中属于益生菌。

益生菌是指定植于人体生殖系统和肠道内，能产生确切健康功效以改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。益生菌能够产生多种健康功效，如可以改善产品风味、降低胆固醇浓度、调节并维持肠道微生态平衡、抗癌抗肿瘤效应、提高乳糖利用率，因而益生菌在保健和医疗等领域具有较大的应用开发潜力。然而，益生菌制剂在生产、保藏及给药过程中，会受到一系列因素的影响，外界因素如温度、湿度等，体内因素如胃酸、消化酶类等，导致到达肠道部位的活菌数量大大减少，限制了益生菌功效的发挥。因此，将益生菌包埋在合适的载体中，如微胶囊内，可以降低不良因素的影响，从而提高益生菌肠道定植的存活率。

自然界中的天然多糖类高分子及其衍生物，具有良好的生物学性能如无毒、亲水溶胀性、生物相容性、生物可降解性；同时，具有聚电解质特性，即溶于水后能产生聚阳离子或聚阴离子基团，因而是制备聚合电解质微胶囊的优选材料。天然多糖类高分子，如氯化壳聚糖，其具备壳聚糖的优良特性，且能够直接溶于水(中性pH环境中)；同时，作为聚阳离子电解质，氯化壳聚糖能够与聚阴离子电解质反应形成聚合电解质复合物薄膜。常用的聚阴离子电解质，如海藻酸钠、纤维素硫酸钠，皆具有可成膜性、生物相容性、生物可降解性等优良性能。通过带有相反电荷的多糖类聚电解质之间、或聚电解质与小分子交联剂之间的相互反应，形成聚合电解质膜用以设计益生菌微载体，如壳聚糖-海藻酸微胶囊、海藻酸钙凝胶微球等，已有较多的研究报道，但依然存在很多不足，如：耐胃酸性能差、存活率低。克服此类问题的主要途径：一是提高益生菌菌株的抗逆性；二是选择合适的载体材料以提高载菌微胶囊的环境耐受性。

发明内容

本发明公开一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，旨在提高地衣芽胞杆菌的抗逆性、环境耐受性，大幅提高活菌通过胃部后的存活率，在载体保护下使大量活菌在肠道部位释放并定植，达到益生保健功效。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

本发明具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法，其特点在于，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将地衣芽孢杆菌菌液接种于pH＝6.4-7.5的液体培养基中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养10-18h，进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将所述活化种子液按2-7％的接种量接种于装有pH＝6.4-7.5的新鲜液体培养基的锥形瓶中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养2-6h，得到地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将所述地衣芽孢杆菌培养物于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，获得沉淀菌体；

按体积比1：4-8向所述沉淀菌体中加入无菌水、振荡混均，再于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，反复洗涤2-3次，最后用无菌水悬浮菌体，得到活菌数≥10⁹cfu/mL的地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将所述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经无菌处理的聚阴离子电解质溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液，在所述内水相菌体悬浮液中聚阴离子电解质浓度为0.01-0.04g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经无菌处理的浓度为0.04-0.1g/mL的小分子溶液作为外水相A液备用；配制经无菌处理的浓度为0.005-0.03g/mL的聚阳离子电解质溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊的制备：将1-5mL的内水相菌体悬浮液以450-850μL·min^-1的流速注入到15-60mL外水相A液中，在200-500rpm转速下保持外水相的低速流动，经室温固化反应5-35min后，收集载菌微胶囊，用无菌水洗涤后缓慢加入到15-60mL外水相B液中，在200-500rpm转速下保持外水相的低速流动，室温包衣反应5-35min后，收集产物并用无菌水均匀洗涤，得到耐胃酸型地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：将所述耐胃酸型地衣芽孢杆菌湿微胶囊低温真空干燥后，在无菌条件下进行真空包装，即得到干燥的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊。

本发明所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特点也在于：

步骤(7)中所述的低温真空干燥为45℃以下的任何一种干燥方式。

步骤(1)中所述的地衣芽孢杆菌菌株为野生型地衣芽胞杆菌、基因工程型地衣芽胞杆菌中的一种或两种。

步骤(1)和步骤(2)中所述的液体培养基为MRS液体培养基、LB液体培养基或大豆豆粕上清液体培养基。其中大豆豆粕上清液体培养基是按如下步骤配制：将大豆豆粕过80目筛，在pH＝8.5的碱性条件下以0.1g/mL的浓度溶解在水中，6000rpm离心15min，取上清液，调pH至6.4-7.5，即得大豆豆粕上清培养基。

步骤(4)和步骤(5)中所述的无菌处理方法为过滤除菌或高温灭菌。

步骤(4)中所述的聚阴离子电解质溶液为海藻酸钠溶液；步骤(5)中所述的聚阳离子电解质溶液为氯化壳聚糖溶液。

步骤(5)中所述的小分子溶液为氯化钙溶液、氯化钡溶液或氯化铁溶液；

步骤(3)和步骤(6)中所述的无菌水为蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。

本发明中微胶囊的双重耐胃酸性原理是：作为聚阴离子的高分子聚电解质如海藻酸钠，其溶于水后质子化使分子链上形成大量的–COO^-基团，经小分子交联剂如Ca²⁺交联固化后形成海藻酸钙凝胶微球，在酸性条件下，微球中的海藻酸形成难溶性凝胶骨架，从而形成“内核”耐酸性屏障，对负载益生菌起到第一重保护功效；而作为聚阳离子的高分子聚电解质如氯化壳聚糖，其溶于水后质子化使分子链上形成大量的–NH₃⁺基团，当载有益生菌的海藻酸钙凝胶微球进入氯化壳聚糖溶液中以后，微球表面海藻酸分子的–COO^-基团立刻与氯化壳聚糖分子的–NH₃⁺基团发生离子反应，通过静电相互作用形成聚合电解质复合物薄膜，该薄膜在酸性条件下难溶于水，从而形成“外壳”耐酸性屏障，对负载益生菌起到第二重保护功效。因此，在“内核”与“外壳”双重屏障的保护下，被负载益生菌能够免受胃液破坏，在肠道部位碱性环境中溶解，实现益生菌的释放与定植。

本发明的有益效果是：在地衣芽孢杆菌菌株扩大培养时采用优化的培养条件，包括温度、pH、时间和培养基，特别是培养基的优化，使地衣芽孢杆菌细胞能够大量繁殖；制备的微胶囊内部呈蜂窝状结构、地衣芽孢杆菌细胞被镶嵌其内，外部呈壳状结构，起到进一步的包覆与隔离作用；结合真空包装，能够使地衣芽孢杆菌细胞处于良好的休眠环境中。通过提高地衣芽孢杆菌的抗逆性、环境耐受性，大幅降低活菌通过胃部后的死亡率，在载体保护下使大量活菌在肠道部位释放并定植，起到益生保健功效。本发明的菌株为地衣芽孢杆菌，载体材料为自然界中的天然多糖类高分子，绿色、安全、环保。该产品不仅可应用于保健食品领域，也可应用于医药领域。

具体实施方式

下面结合具体施例对本发明的技术方案作进一步的说明，旨在更好的解释本发明的内容， 以下实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的野生型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL 331菌液接种于MRS液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养15h进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按4％的接种量接种于装有pH 6.8的新鲜MRS液体培养基的锥形瓶中，在37℃、200rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、4000rpm转速下离心30min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：4的比例向沉淀菌体中加入蒸馏水、振荡混均；与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用蒸馏水悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经过滤除菌处理的海藻酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中海藻酸钠浓度为0.02g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经过滤除菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经过滤除菌处理的浓度为0.005g/mL的氯化壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊的制备：使用10mL规格的无菌注射器将2mL的内水相菌体悬浮液，以450μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到20mL体系的外水相A液中，在磁力搅拌器作用下(200rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应15min后，收集载菌微胶囊，用蒸馏水洗涤三次，再缓慢加入到20mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应15min后，收集产物，用蒸馏水均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(12h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，地衣芽孢杆菌的存活率≥90％，耐受模拟胃酸的pH≥0.5；乳白色，无异味，该产品可应用于保健食品和医药领域。

实施例2

本实施例具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的野生型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL 331菌液接种于MRS液体培养基中，在39℃、240rpm条件下培养15h进 行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按6％的接种量接种于装有pH 7.2的新鲜MRS液体培养基的锥形瓶中，在39℃、240rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、6000rpm转速下离心20min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：6的比例向沉淀菌体中加入生理盐水、振荡混均；与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用生理盐水悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述菌悬液加入到经高温灭菌处理的海藻酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中海藻酸钠浓度为0.04g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经高温灭菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经高温灭菌处理的浓度为0.01g/mL的氯化壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊制备：使用20mL规格的无菌注射器将4mL的内水相菌体悬浮液，以650μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到40mL体系的外水相A液中，在磁力搅拌器作用下(300rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应25min后，收集载菌微胶囊，用生理盐水洗涤三次，再缓慢加入到40mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应25min后，收集产物，用生理盐水均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(24h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，地衣芽孢杆菌的存活率≥95％，耐受模拟胃酸的pH≥1.0；乳白色，无异味，该产品可应用于保健食品和医药领域。

实施例3

本实施例地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的野生型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL 331菌液接种于MRS液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养15h进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按4％的接种量接种于装有pH 6.8的新鲜MRS液体培养基的锥形瓶中，在37℃、200rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、4000rpm转速下离心30min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：4的比例向沉淀菌体中加入蒸馏水、振荡混均；与前述 相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用蒸馏水悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经过滤除菌处理的纤维素硫酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中纤维素硫酸钠浓度为0.02g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经过滤除菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经过滤除菌处理的浓度为0.005g/mL的氯化壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊的制备：使用10mL规格的无菌注射器将2mL的内水相菌体悬浮液，以450μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到20mL体系的外水相A液中，在磁力搅拌器作用下(200rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应15min后，收集载菌微胶囊，用蒸馏水洗涤三次，再缓慢加入到20mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应15min后，收集产物，用蒸馏水均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(12h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，微胶囊产品崩解，益生菌死亡(pH≥0.5)，不具备耐胃酸特性。

实施例4

本实施例具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的野生型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL 331菌液接种于LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养15h进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按4％的接种量接种于装有pH 6.8的新鲜液体LB培养基的锥形瓶中，在37℃、200rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、4000rpm转速下离心30min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：4的比例向沉淀菌体中加入生理盐水、振荡混均；与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用生理盐水悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经过滤除菌处理的海藻酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中海藻酸钠浓度为0.02g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经过滤除菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经过滤除菌处理的浓度为0.005g/mL的氯化壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊的制备：使用10mL规格的无菌注射器将2mL的内水相菌体悬浮液，以450μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到20mL体系的外水相A液中，在磁力搅拌器作用下(200rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应15min后，收集载菌微胶囊，用生理盐水洗涤三次，再缓慢加入到20mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应15min后，收集产物，用生理盐水均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(12h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，地衣芽孢杆菌的存活率≥95％，耐受模拟胃酸的pH≥2.0；乳白色，无异味，该产品可应用于保健食品和医药领域。

实施例5

本实施例具有高存活率的地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的基因工程型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL GE331菌液接种于LB液体培养基中，在35℃、180rpm条件下培养15h进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按6％的接种量接种于pH 7.2的装有新鲜液体LB培养基的锥形瓶中，在39℃、240rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、6000rpm转速下离心40min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：6的比例向沉淀菌体中加入磷酸盐缓冲液、振荡混均；与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用磷酸盐缓冲液悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述菌悬液加入到经高温灭菌处理的海藻酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中海藻酸钠浓度为0.04g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经高温灭菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经高温灭菌处理的浓度为0.01g/mL的氯化壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊制备：使用20mL规格的无菌注射器将4mL的内水相菌体悬浮液，以650μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到40mL体系的外水相A液中，在磁力搅 拌器作用下(300rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应25min后，收集载菌微胶囊，用磷酸盐缓冲液洗涤三次，再缓慢加入到40mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应25min后，收集产物，用磷酸盐缓冲液均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(12h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，地衣芽孢杆菌的存活率≥90％，耐受模拟胃酸的pH≥1.0；乳白色，无异味，该产品可应用于保健食品和医药领域。

实施例6

本实施例地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的基因工程型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL GE331菌液接种于LB液体培养基中，在35℃、180rpm条件下培养15h进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按6％的接种量接种于pH 7.2的装有新鲜液体LB培养基的锥形瓶中，在39℃、240rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、6000rpm转速下离心40min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：6的比例向沉淀菌体中加入磷酸盐缓冲液、振荡混均；与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用磷酸盐缓冲液悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述菌悬液加入到经高温灭菌处理的纤维素硫酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中纤维素硫酸钠浓度为0.04g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经高温灭菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经高温灭菌处理的浓度为0.01g/mL的壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊制备：使用20mL规格的无菌注射器将4mL的内水相菌体悬浮液，以650μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到40mL体系的外水相A液中，在磁力搅拌器作用下(300rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应25min后，收集载菌微胶囊，用磷酸盐缓冲液洗涤三次，再缓慢加入到40mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应25min后，收集产物，用磷酸盐缓冲液均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(12h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，微胶囊产品崩解，益生菌死亡(pH≥1.0)，不具备耐胃酸特性。

实施例7

本实施例具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的基因工程型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL GE331菌液接种于大豆豆粕上清液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养15h进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按4％的接种量接种于装有pH 6.8的新鲜大豆豆粕上清液体培养基的锥形瓶中，在37℃、200rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、4000rpm转速下离心30min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：4的比例向沉淀菌体中加入蒸馏水、振荡混均；与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用蒸馏水悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经过滤除菌处理的海藻酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中海藻酸钠浓度为0.02g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经过滤除菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经过滤除菌处理的浓度为0.005g/mL的氯化壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊的制备：使用10mL规格的无菌注射器将2mL的内水相菌体悬浮液，以450μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到20mL体系的外水相A液中，在磁力搅拌器作用下(200rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应15min后，收集载菌微胶囊，用蒸馏水洗涤三次，再缓慢加入到20mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应15min后，收集产物，用蒸馏水均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(12h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，地衣芽孢杆菌的存活率≥90％，耐受模拟胃酸的pH≥0.5；乳白色，无异味，该产品可应用于保健食品和医药领域。

实施例8

本实施例具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤:

(1)菌株活化：将-80℃左右条件下甘油保存的已融化的基因工程型地衣芽孢杆菌B.licheniformis IBL GE331菌液接种于大豆豆粕上清液体培养基中，在39℃、240rpm条件下培养15h进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将活化种子液按6％的接种量接种于pH 7.2的装有新鲜液大豆豆粕上清液体培养基的锥形瓶中，在39℃、240rpm条件下培养4h，得到高浓度的地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将地衣芽孢杆菌培养物于4℃、6000rpm转速下离心30min，去除上清液，获得沉淀菌体；按体积比1：6的比例向沉淀菌体中加入生理盐水、振荡混均；与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤3次，最后用生理盐水悬浮菌体，其活菌数≥10⁹cfu/mL，得到地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将上述菌悬液加入到经高温灭菌处理的海藻酸钠溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液；在内水相菌体悬浮液中海藻酸钠浓度为0.04g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经高温灭菌处理的浓度为0.06g/mL的氯化钙溶液作为外水相A液备用；配制经高温灭菌处理的浓度为0.01g/mL的氯化壳聚糖溶液作为外水相B液备用；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊制备：使用20mL规格的无菌注射器将4mL的内水相菌体悬浮液，以650μL·min^-1的流速用恒流注射泵注入到40mL体系的外水相A液中，在磁力搅拌器作用下(300rpm)保持外水相的低速流动；经室温固化反应25min后，收集载菌微胶囊，用生理盐水洗涤三次，再缓慢加入到40mL体系的外水相B液中，与前述相同条件下室温包衣反应25min后，收产物，用磷酸盐缓冲液均匀洗涤三次，得到地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：载菌湿微胶囊经低温真空干燥后(24h)，在无菌条件下进行真空包装，得到负载地衣芽孢杆菌的干燥微胶囊。

该地衣芽胞杆菌干微胶囊产品经模拟胃液1h测试后，地衣芽孢杆菌的存活率≥95％，耐受模拟胃酸的pH≥1.0；乳白色，无异味，该产品可应用于保健食品和医药领域。

一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。