专利摘要
本发明公开一种短乳杆菌的培养方法，其包括在适于菌株生长的环境下使固定化短乳杆菌PL6‑1在培养基中生长或增殖的步骤，其中培养基包含白菜提取液、葡萄糖、酵母提取液和金属盐。本发明的方法使用白菜提取液作为培养基的主要成分，其发酵效果与现有培养基基本一致，但是成本大大降低，例如成本是MRS培养基的1/20。
权利要求
1.一种短乳杆菌的培养方法，其特征在于，包括在适于菌株生长的环境下使固定化短乳杆菌PL6-1在培养基中生长或增殖的步骤，其中所述培养基包含白菜提取液、葡萄糖、酵母提取液和金属盐。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述短乳杆菌PL6-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.19868。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述固定化短乳杆菌PL6-1通过使短乳杆菌PL6-1的细胞悬液与海藻酸钠溶液混合而得到。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的浓度为1.5-3.0％，固定化细胞的珠粒大小为1.6-2.2mm，珠粒中细胞计数为5.5-9.0logCFU/g。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养基中，白菜提取液为20-35重量份，葡萄糖为2-6重量份，酵母提取液为0.2-4.5重量份和金属盐为0.3-2.2重量份。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述金属盐包括氯化钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、硫酸镁和硫酸锰。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述白菜提取液为白菜废弃物提取液。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述适于菌株生长的环境下包括25-40℃的温度和2.5-5.0的pH值。
说明书
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及短乳杆菌菌株的培养方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种天然存在的四碳非蛋白质氨基酸，对中枢神经性疾病、高血压、癌症、糖尿病、人体免疫力等都具有调节作用。除植物富集外，食品级GABA主要通过微生物谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)作用底物谷氨酸生产。乳酸菌普遍被认为安全无毒，且对人体具有较好的益生效果，利用乳酸菌发酵生产GABA 是一种比较安全理想的生产方式，具有成本低、含量高及安全可用于食品的优点。
利用微生物发酵来生产γ-氨基丁酸是一种高效的方法。目前已公开了多种用于发酵生产γ-氨基丁酸的细菌。例如CN106479932A即公开了一种产γ- 氨基丁酸的戊糖乳杆菌。另外，还公开了多种用于发酵生产γ-氨基丁酸的短乳杆菌。例如，CN103966139A公开了四川泡菜中一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌。该菌分离于四川泡菜，具有在含谷氨酸钠的培养基中产生γ-氨基丁酸的能力。但该菌株利用糙米粉为培养基，虽然降低了成本，但是其产量仍达不到高产的要求。再例如，CN101333508A公开了一种高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，其培养基为MRSG液体培养基，于25-30℃培养60-90h，发酵液中的γ-氨基丁酸达到50-145mM。另外，CN1673351A公开了一种产γ-氨基丁酸的短乳杆菌，其在MRS发酵培养基中的产量为2g/L，在GYP发酵培养基中的产量为4g/L。
微生物培养时，培养基的选择要考虑生产成本、细胞生产效率和易收获性。综上所述，目前仍需要以更低成本高产γ-氨基丁酸的技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种短乳杆菌菌株的培养方法，其能够在降低GABA生产成本的同时提高GABA的产量和转化率。具体地，本发明包括以下内容。
本发明提供一种短乳杆菌的培养方法，其包括在适于菌株生长的环境下使固定化短乳杆菌PL6-1在培养基中生长或增殖的步骤，其中所述培养基包含白菜提取液、葡萄糖、酵母提取液和金属盐。
根据本发明所述的培养方法，优选地，所述短乳杆菌PL6-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.19868。
根据本发明所述的培养方法，优选地，所述固定化短乳杆菌PL6-1通过使短乳杆菌PL6-1的细胞悬液与海藻酸钠溶液混合而得到。
根据本发明所述的培养方法，优选地，所述海藻酸钠溶液的浓度为 1.5-3.0％，固定化细胞的珠粒大小为1.6-2.2mm，珠粒中细胞计数为5.5-9.0 logCFU/g。
根据本发明所述的培养方法，优选地，所述培养基中，白菜提取液为 20-35重量份，葡萄糖为2-6重量份，酵母提取液为0.2-4.5重量份和金属盐为0.3-2.2重量份。
根据本发明所述的培养方法，优选地，所述金属盐包括氯化钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、硫酸镁和硫酸锰。
根据本发明所述的培养方法，优选地，所述白菜提取液为白菜废弃物提取液。
根据本发明所述的培养方法，优选地，所述适于菌株生长的环境下包括 25-40℃的温度和2.5-5.0的pH值。
本发明的短乳杆菌菌株具有优异的发酵特性，其γ-氨基丁酸(GABA)产量以及转化率显著高于其他产γ-氨基丁酸菌株。该菌株的谷氨酸脱羧酶 (GAD)具有较好的pH和温度耐受性，在较宽pH和温度范围内依然保持较高的酶活性质，具有理想的热稳定性，同时该菌株具有一定的抑菌性和耐酸性能。
此外，本发明的方法使用白菜提取液作为培养基的主要成分，其发酵效果与现有培养基基本一致，但是成本大大降低，例如成本是MRS培养基的 1/20。
附图说明
图1为Lactobacillus brevis PL6-1的电镜图。
图2为Lactobacillus brevis PL6-1的革兰氏染色显微图。
图3为发酵液中的谷氨酸和GABA的高效液相色谱图。
图4为白菜废弃物综合利用流程。
图5为Lactobacillus brevis PL6-1所含GAD酶的最适pH测定结果。
图6为Lactobacillus brevis PL6-1所含GAD酶的最适温度的测定结果。
图7为Lactobacillus brevis PL6-1的GAD酶在50-90℃的热稳定性(其中RA表示相对活性)。
图8为Lactobacillus brevis PL6-1的GAD酶的log D-T曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明中，术语“白菜提取液培养基”是指以白菜提取液为主要成分的培养基，其用于本发明的短乳杆菌的发酵。因此其含义与“用于短乳杆菌发酵的培养基”具有相同含义。本文有时简称为“本发明的培养基”。
CGMCC是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的缩写，是根据国际认可用于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约用于保存微生物菌株目的的国际保藏机构，其地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明提供一种短乳杆菌菌株、用于培养短乳杆菌的方法、一种白菜提取液培养基、短乳杆菌菌株在制备泡菜和果块气泡水中的用途以及生产γ-氨基丁酸的方法，在提高GABA产量、产率的同时，大大降低生产成本，具体如下：
实施例
本发明从泡菜中分离筛选出1株高产GABA的乳酸菌株，经鉴定该菌株为短乳杆菌，其电镜图如图1所示，命名为Lactobacillus brevis PL6-1。该菌株为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，形状为短杆状，发酵pH为4.81，来源为萝卜泡菜，革兰氏染色显微结果如图2所示。现已将该菌株于2020年5 月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为： CGMCC No.19868，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
1.生理生化特性测定
菌株PL6-1的API 50CHL反应结果如表1所示：
表1菌株PL6-1的API 50CHL反应结果
注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“V”代表可变的，“D”代表延迟反应
2.菌株PL6-1在MRS培养基中GABA产量测定
该菌株在添加10％谷氨酸钠(MSG)的MRS培养基中，发酵72小时 GABA产量达到520mM(53.67g/L)，转化率达到97.4％，高于文献中其它菌株在优化的MRS培养基中GABA的产量，具体如表2所示。发酵液中的谷氨酸(Glu)和GABA的高效液相色谱图如图3所示。
表2不同菌株在MRS培养基中GABA的产量
3.菌株PL6-1在白菜提取液培养基中GABA产量测定
3.1白菜提取液培养基开发
取白菜废弃物与水混合(1:1，w/v)，100℃萃取10min，压榨后，提取液用来开发乳酸菌培养基，残渣用来开发高纤维粗粮饼干(白菜废弃物综合利用流程如图4所示)。
选定白菜废弃物提取液浓度、不同碳源(葡萄糖、果糖、麦芽糖)、不同氮源(酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏蛋白胨)、不同盐浓度及培养基初始 pH为主要优化参数。通过优化得到白菜废弃物培养基最佳组成为每升30％白菜废弃物提取液、3％葡萄糖、0.25％酵母提取液和金属盐(0.25％乙酸钠、 0.1％柠檬酸钠、0.1％硫酸铵、0.005％硫酸镁、0.0025％硫酸锰)，初始pH 值为5.0。在该培养基中，细胞计数为4.16×10
3.2培养基优化
为获得较高的GABA转化率，用反应曲面法优化了含10％MSG的白菜废弃物培养基。最佳组成为21.84％的白菜废弃物提取液、5.5％葡萄糖、4％酵母提取液、1％乙酸钠、0.4％柠檬酸钠、0.4％硫酸铵、0.02％硫酸镁、0.01％硫酸锰，0.2％磷酸二钠，初始pH值为4.5。在优化的培养基中，GABA转化率在48h达到100％，最终GABA产量为534mM，与其他文献作对比，Lactobacillus brevis PL6-1的产率和产量都较大。尤其是在48h就能达到如此大的产量，且纯度较高，其生产效率显著高于其他文献中的GABA产量(如表3所示)。
表3文献中不同菌株生产GABA的效率
4.菌株PL6-1所含GAD酶的最适pH和最适温度测定
4.1 GAD酶的最适pH测定
在37℃条件下，利用0.2mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.5～3.5)、0.2 mol/L吡啶-HCl缓冲液(pH 3.5～6.0)和0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.0～ 8.0)中加入20mM谷氨酸钠和0.1mM磷酸吡哆醛(PLP)，在pH 2.5～8.0 范围内测定GAD酶活性的最佳pH值。最适pH测定结果如图5所示，GAD 活性的最适pH值在3.0～5.0的范围内，这与以往研究中的其他乳酸菌GAD 酶的最适pH有显著不同(不同菌株所含GAD酶的特征如表4所示)。GABA 在乳酸菌中的生物合成受到严格的pH调节，微生物GAD酶的最适pH值一般为3.8～5.0，其中乳酸菌GAD酶的最适pH值在4.0～5.0之间。pH值的升高或降低可能导致GAD酶活性的部分丧失。本发明菌株PL6-1所含GAD 酶在较宽的pH范围内能保持较高的活性。即使在pH 2.5条件下，其相对活性也为70.59％，明显高于其它乳酸菌。本发明菌株PL6-1所含GAD酶与 GAD酶的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)呈负相关，菌株PL6-1生产GABA的能力不受PLP添加量的影响。
表4不同菌株所含GAD酶的特征
NI：未检测；+：正相关；-：负相关。
4.2 GAD酶的最适温度测定
在pH值为4.5的0.2mol/L吡啶-HCl缓冲液中，用20～80℃的温度范围确定GAD酶活性的最佳温度。测得GAD的最适温度为65℃，如图6所示。乳酸菌的GAD酶最适温度一般为30～50℃，本发明中短乳杆菌PL6-1 中GAD酶的最适温度明显高于表4中所示的其他乳酸菌种。
5.菌株PL6-1所含GAD酶的耐热性
在50～90℃条件下孵育GAD酶3h，测定酶的热稳定性，并测定酶的剩余活性。GAD热稳定性曲线如图7所示。GAD活性在80℃以上迅速下降。在70℃孵育1h后，GAD活性保持在原来的40.13％左右。60℃孵育1h、2h 和3h后，GAD活性分别为90.49％、78.78％和64.20％。50℃下孵育1h、2 h和3h后分别为98.49％、96.29％和94.29％。其它文献中，副干酪乳杆菌的GAD在20～40℃的温度范围内是稳定的。唾液链球菌GAD在pH 4.0下50℃孵育1h后，保留了97.19％以上的GAD活性。本发明的菌株PL6-1所含GAD 酶的热稳定性明显高于以往的研究。
此外，本发明的菌株PL6-1所含GAD酶在50℃、60℃和70℃的D值如表5所示，分别为7143min、971min和124min。图8为Z值GAD的logD-T 图，Z值为11.36。
表5 Lactobacillus brevis PL6-1的GAD酶热稳定性参数
6.菌株PL6-1的抑菌性
经抑菌性实验测定，该菌同时对革兰氏阳性菌的蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、单增李斯特菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌具有抗菌性。将PL6-1发酵上清液pH值调至7.0，排除了有机酸的干扰；经过氧化氢酶处理后抑菌效果无明显差别，排除了过氧化氢的干扰。发酵上清液经α-胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抑菌性发生了不同程度的改变，从而证明主要抑菌物质为细菌素。
7.固定化菌株发酵
通过不同比例细胞菌悬液与海藻酸钠混合以后，固定化细胞内包埋的细胞数，以及扩散到CaCl2溶液中的细胞数做比较，选定细胞菌悬液与海藻酸钠的混合比例为2:5，这时的海藻酸钠浓度为2.86％。培养基配方为：每升30％白菜废弃物提取液、3％葡萄糖、0.25％酵母提取液和金属盐(0.25％乙酸钠、 0.1％柠檬酸钠、0.1％硫酸铵、0.005％硫酸镁、0.0025％硫酸锰)，初始pH值为5.0。
将固定化细胞在上述培养基中发酵，发现与未固定化细胞相比，固定化细胞具有更高的培养基利用率及GABA的产量和产率。GABA的平均生产率达到94.46％，共生产GABA807mmol/L，初始细胞数为：7.70×10
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
短乳杆菌的培养方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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