专利摘要
本发明涉及一种应用于北极丝状真菌生产二萜类化合物的发酵培养基。本发明的培养基适于丝状真菌Eutypellasp.的生长，且可大大提高二萜类化合物LibertellenoneH的产量。
权利要求
1.一种培养北极丝状真菌Eutypella sp.及生产Libertellenone H的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：
3.如权利要求1-2任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，各组分配制于水中；和/或所述培养基的pH值5.8±0.5。
4.权利要求1-3任一所述的培养基的用途，用于培养北极丝状真菌Eutypella sp.，生产二萜类化合物Libertellenone H。
5.一种制备权利要求1-3任一所述的北极丝状真菌Eutypella sp.的培养基的方法，所述方法包括：
(1)配制六水氯化钴和氯化钙的母液；
(2)将蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素用适量的水溶解；与(1)配制的六水氯化钴和氯化钙的母液混合；
其中，各组分的用量按照权利要求1-3任一所述。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括：将pH调至5.8±0.5，在115℃灭菌20min。
7.一种利用北极丝状真菌Eutypella sp.生产Libertellenone H的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-3任一所述的培养基培养北极丝状真菌Eutypella sp.，从而生产Libertellenone H。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将北极丝状真菌Eutypella sp.的种子液按体积比5-10％的接种量接种入前面任一所述的培养基，置于20℃、180r/min摇床培养8-12天，获得发酵液，其中含有二萜类化合物Libertellenone H。
9.一种用于培养北极丝状真菌Eutypella sp.的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：权利要求1-3任一所述的培养基。
说明书
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及用于北极丝状真菌Eutypella sp.生产二萜类化合物Libertellenone H的发酵培养基组成，通过培养基优化的方法提高Libertellenone H的产量。
背景技术
由于病原体对各种药物耐药性的加强以及一些常用药物严重且长期的副作用，开发新的治疗药物尤为迫切。极地地区由于常年低温、气候干燥、反复冻融、强紫外辐射、光照时间长及营养贫乏等严重限制了植物和动物的生长，耐受力强的微生物却在极地生态系统中发挥着重要作用。近年来，由于极地微生物能产生结构新颖的次级代谢物，逐渐成为开发新药物的重要的潜在资源。
弯孢聚壳菌D-1(Eutypella sp.D-1，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2013144)是分离自北极高纬度(78°55’N)仙女木根基土壤的一株丝状真菌，该属真菌在全球分布较为广泛，且能够产生许多结构新颖、功能独特的次级代谢物，比如桉烷型倍半萜、海松烷型二萜、三萜、细胞松弛素类、聚酮类和环二肽类化合物。从该菌发酵产物中分离鉴定的两种新型异海松烷型二萜类化合物Libertellenone G和Libertellenone H对人肺癌细胞株H460、人胶质瘤细胞株U251、人胃癌细胞株SG7901、人胰腺癌细胞株SW1990、人子宫颈癌细胞株Hela和人肝癌细胞株Huh-7这7种肿瘤细胞株均有一定抑制活性。其中Libertellenone H对Mcf-7乳腺癌的抑制作用最强，IC50达到了3.31μmol/L，和阳性对照紫杉醇的IC50相当，具有开发应用前景。
然而Libertellenone H的原始产量极低(低于HPLC检出限)，严重限制了后续的药理药效及临床研究，因此需要通过发酵培养基优化来提高Libertellenone H的产量，为其后续大规模发酵及作为抗癌候选药物开发奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供用于北极丝状真菌Eutypella sp.生产二萜类化合物Libertellenone H的发酵培养基组成及制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种北极丝状真菌(Eutypella sp.)的培养基，所述培养基包括以下组分：
在本发明的一个优选例中，所述培养基包括以下组分：
在本发明的另一优选例中，所述培养基包括以下组分：
在本发明的另一优选例中，所述培养基包括以下组分：
其中，各组分在培养基中的含量可在±10％(更佳地±5％)范围内浮动。
在本发明的另一优选例中，所述培养基中，各组分配制于水中；所述的水较佳地是去离子水。
在本发明的另一优选例中，所述培养基的pH值5.8±0.5。
在本发明的另一优选例中，所述的北极丝状真菌Eutypella sp.是Eutypella sp.D-1。
在本发明的另一方面，提供所述的培养基的用途，用于培养北极丝状真菌(Eutypella sp.)，生产二萜类化合物Libertellenone H。
在本发明的另一方面，提供制备所述的北极丝状真菌(Eutypella sp.)的培养基的方法，所述方法包括：
(1)配制六水氯化钴和氯化钙的母液；
(2)将蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素用适量的水溶解；与(1)配制的六水氯化钴和氯化钙的母液混合；其中，各组分的用量按照前面任一所述。
在本发明的一个优选例中，所述的方法还包括：将pH调至5.8±0.5，在15℃灭菌20min。
在本发明的另一方面，提供一种利用北极丝状真菌(Eutypella sp.)生产Libertellenone H的方法，所述方法包括：利用所述的培养基培养北极丝状真菌(Eutypella sp.)，从而生产Libertellenone H。
在本发明的另一优选例中，将北极丝状真菌(Eutypella sp.)的种子液按体积比5-10％的接种量接种入前面任一所述的培养基，置于20℃、180r/min摇床培养8-12天，获得发酵液，其中含有二萜类化合物Libertellenone H。
在本发明的另一方面，提供一种用于培养北极丝状真菌(Eutypella sp.)的试剂盒，所述试剂盒中包括本发明前面所述的培养基。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，研究开发了一种新的适合于北极丝状真菌Eutypella sp.高效生产二萜类化合物Libertellenone H的培养基配方。本发明的培养基，适合于北极丝状真菌Eutypella sp.的生长，且可大幅提高Libertellenone H的产量。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
术语“本发明的北极丝状真菌(Eutypella sp.)的培养基”指含有蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素，以及可选的六水氯化钴和氯化钙的组合物；或基本上由蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素，以及可选的六水氯化钴和氯化钙组成的组合物。在组合物中，所述的蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素以及可选的六水氯化钴、氯化钙占培养基总重量的80-100％，较佳地占90-100％，更佳地占95-100％，如98％，99％。
作为本发明的优选方式，所述的培养基中还添加六水氯化钴和氯化钙，六水氯化钴和氯化钙的添加量以提高菌体生长和生产所需为宜，本领域技术人员可按照经验添加。
作为本发明的优选方式，用于配制本发明的北极丝状真菌(Eutypella sp.)(更佳的是Eutypella sp.D-1)培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
根据本发明的揭示，在得知了本发明的北极丝状真菌(Eutypella sp.)(更佳的是Eutypella sp.D-1)培养基所用的组分及其配方以后，本领域技术人员可方便地配制所述的培养基。
本发明的培养基的应用的组分(原料)均为商业化的普通化学产品，价格比较低，制备也非常简单，与现有技术的培养基相比，本发明的新型培养基能显著促进北极丝状真菌(Eutypella sp.)发酵生产Libertellenone H，Libertellenone H的产量得到显著提高，有利于大规模工业化生产。
作为本发明的优选方式，在配制所述的北极丝状真菌(Eutypella sp.)(更佳的是Eutypella sp.D-1)培养基时，先分别准确称取各组分，将它们混合于水中。所述的水较佳地为去离子水。更优选的，提供一种用于制备上述培养基的方法，包括步骤：
(a)配制微量元素六水氯化钴和氯化钙的高浓度(1000倍)母液；
(b)将所述蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素用适量的水溶解；
(c)在上述溶液中添加六水氯化钴和氯化钙微量元素的母液；
作为本发明的优选方式，步骤(c)之后，进一步包括：将pH调至5.8±0.5，在115℃灭菌20min。
在本发明的具体实施例中，还提供了使用所述培养基培养北极丝状真菌(Eutypella sp.)(更佳的是Eutypella sp.D-1)发酵生产Libertellenone H的发酵方法，包括步骤：
(a)用接种环挑取保种管中的菌丝垂直插入固体培养基中央，于28℃条件下培养7～8d；
(b)采用普通锥形瓶培养种子液，8层纱布保证无菌透气。用直径1cm的打孔器在固体平板上打孔，用接种铲将琼脂圆块均匀切割成4块，接种于装有100ml种子培养基的锥形瓶中，置于28℃、180r/min摇床中培养3.5d(视种子的具体生长情况而定)，按照5％(v/v)接种量接入相同种子培养基，于28℃、180r/min摇床培养2.5d，获得新鲜二级种子液，用于发酵培养；
(c)采用普通锥形瓶发酵培养，在装液量为50ml的锥形瓶中按照5％(v/v)的接种量接入新鲜种子液，置于20℃、180r/min摇床培养10d获得发酵液。
较佳地，将-80℃保存的菌种解冻后，用无菌接种环挑取菌丝，垂直插入固体培养基中央，置于28℃恒温培养箱中，活化培养7～8d，获得新鲜固体平板，然后置于4℃冰箱保存待用，以后固体平板每隔30d重新活化一次。
较佳地，每升活化培养基包含有葡萄糖20g/L，马铃薯浸出粉10g/L，其余为去离子水，在121℃灭菌20-30min。较佳地，每升固体平板活化培养基是在活化培养基的基础上添加琼脂粉15-20g。
本发明还提供了一种上述发酵方法生产的Libertellenone H的检测方法，其操作步骤包括：
取培养至10d的发酵液10ml，加入等体积乙酸乙酯，并加入30颗玻璃珠(直径为3-5mm)，封口后，于摇床20℃、180r/min条件下萃取36h，将其全部转移到50ml离心管中，4500r/min离心10min后，取上层有机相进行真空旋转蒸发(37℃)，旋干后，在茄形烧瓶中加入1.5ml的甲醇，超声助溶，将洗涤液转移至1.5ml离心管中，于13400g离心10min后取上清，置于4℃保存，并用HPLC进行产物的检测。
本发明的有益效果具体如下：
1.本发明的新型培养基成分包括蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素，以及可选的六水氯化钴、氯化钙，均为常见试剂，原料易得，用量少，成本低；
2.制备本发明的新型培养基时，先将蔗糖、硝酸钠、三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、硫酸亚铁、尿素用适量去离子水溶解，再添加少量微量元素液，定容即可，制备简单；
3.采用本发明的新型发酵培养基培养北极丝状真菌Eutypella sp.D-1，发酵结束时，从该菌株发酵萃取物中检测到的Libertellenone H的产量有显著提高，最终产量从原来的0.18mg/L提高到10.7mg/L，大约是原始水平的59倍。该发明对于后续北极丝状真菌Eutypella sp.D-1的大规模发酵培养及Libertellenone H的药理药效研究具有重要的指导意义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、培养基1
1.1实验菌株及保藏方法
弯孢聚壳菌D-1(Eutypella sp.D-1，菌种保藏编号：CCTCC M2013144)由中国人民解放军第二军医大学提供。菌株接种于种子培养液中培养3.5d后获得新鲜种子液，50％甘油与新鲜种子液按2:3比例混合于保种管，-80℃冷冻保藏，并取新鲜种子液于安瓿管中经冷冻真空干燥保存。
1.2固体平板、种子培养基及发酵培养基1的配制
固体平板及种子液体培养基：
培养基的pH调至5.8。固体平板培养基则是在此基础上添加2％的琼脂粉，于121℃条件下灭菌20min。
发酵培养基1：
pH调至5.8，于115℃条件下灭菌20min。
1.3发酵生产二萜类化合物Libertellenone H
固体平板培养：用接种环挑取保种管中的菌丝垂直插入固体培养基中央，于28℃条件下培养7～8d。
种子培养：种子液均采用500ml普通锥形瓶培养，8层纱布保证无菌透气。用直径1cm的打孔器在固体平板上打孔，用接种铲将琼脂圆块均匀切割成4块，接种于装有100ml种子培养基的锥形瓶中，置于28℃、180r/min摇床中培养3.5d(视种子的具体生长情况而定)，按照5％(v/v)接种量接入相同种子培养基，于28℃、180r/min摇床培养2.5d，获得新鲜二级种子液，用于发酵培养。
摇瓶发酵培养：发酵培养均采用250ml的普通锥形瓶培养，在装液量为50ml的锥形瓶中按照5％(v/v)的接种量接入新鲜种子液，置于20±1℃、180±20r/min摇床培养10天。
1.4二萜类化合物Libertellenone H产量的测定
取上一步骤制备的发酵液10ml，加入等体积乙酸乙酯，并加入30颗玻璃珠(直径为3-5mm)，封口后，于摇床20℃、180r/min条件下萃取36h，将其全部转移到50ml离心管中，4500r/min离心10min后，取上层有机相进行真空旋转蒸发(37℃)，旋干后，在茄形烧瓶中加入1.5ml的甲醇，超声助溶，将洗涤液转移至1.5ml离心管中，于13400g离心10min后取上清，置于4℃保存，并用HPLC进行产物的检测。
HPLC检测条件：高效液相色谱仪(Agilent 1200)，液相色谱柱为Kromasil-C18(250mm×4.6mm, )，柱温25℃，检测波长332nm，流速1ml/min，进样量为20μl，流动相为0.1％乙酸(A相)和乙腈(B相)，洗脱梯度为：0～10min，5～60％B相；10～30min，60％B相；30.1～35min，100％B相。Libertellenone H标准品的停留时间为26-27min。对所得液相峰积分并计算峰面积，然后根据标准曲线(y＝24.369x+1.6144，R2＝0.9999)换算得到产物产量，其中y为峰面积，x为进样浓度(mg/L)。
在发酵培养基1中，Eutypella sp.D-1所产的Libertellenone H的产量为0.18mg/L。
实施例2、培养基2(葡萄糖作为碳源)
2.1固体平板、种子培养基及发酵培养基2的配制
固体平板及种子液体培养基的配制同实施例1的步骤1.2。
发酵培养基2：
pH调至5.8，于115℃条件下灭菌20min。
2.2发酵生产二萜类化合物Libertellenone H
应用发酵培养基2进行生产，方法同实施例1的步骤1.3。
2.3菌体生长及Libertellenone H产量的测定
同实施例1的步骤1.4，测得Libertellenone H的产量达到了0.21mg/L。
实施例3、培养基3(蔗糖作为碳源)
3.1固体平板、种子培养基及发酵培养基3的配制
固体平板及种子液体培养基的配制同实施例1的步骤1.2。
发酵培养基3：
pH调至5.8，于115℃条件下灭菌20min。
3.2发酵生产二萜类化合物Libertellenone H
应用发酵培养基3进行生产，方法同实施例1的步骤1.3。
3.3二萜类化合物Libertellenone H产量的测定
同实施例1的步骤1.4，测得Libertellenone H的产量达到了0.52mg/L。
实施例4、培养基4
4.1固体平板、种子培养基及发酵培养基4的配制
单因素实验确定硝酸钠、三水磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、酵母提取物、L-鸟氨酸盐酸盐的较适浓度。固体平板及种子液体培养基的配制同实施例1的步骤1.2。
发酵培养基4：
pH调至5.8，于115℃条件下灭菌20min。
4.2发酵生产二萜类化合物Libertellenone H
应用发酵培养基4进行生产，方法同实施例1的步骤1.3。
4.3二萜类化合物Libertellenone H产量的测定
同实施例1的步骤1.4，测得Libertellenone H的产量达到了0.75mg/L。
实施例5、培养基5(以尿素为氮源)
5.1固体平板、种子培养基及发酵培养基5的配制
固体平板及种子液体培养基的配制同实施例1的步骤1.2。
发酵培养基5：
pH调至5.8，于115℃条件下灭菌20min。
5.2发酵生产二萜类化合物Libertellenone H
应用发酵培养基5进行生产，方法同实施例1的步骤1.3。
5.3二萜类化合物Libertellenone H产量的测定
同实施例1的步骤1.4，测得Libertellenone H的产量达到了2.35mg/L。
实施例6、培养基6(尿素较佳浓度验证)
6.1固体平板、种子培养基及发酵培养基6的配制
固体平板及种子液体培养基的配制同实施例1的步骤1.2。
发酵培养基6：
pH调至5.8，于115℃条件下灭菌20min。
6.2发酵生产二萜类化合物Libertellenone H
应用发酵培养基6进行生产，方法同实施例1的步骤1.3。
6.3二萜类化合物Libertellenone H产量的测定
同实施例1的步骤1.4，测得Libertellenone H的产量达到了10.7mg/L。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
应用于北极丝状真菌生产二萜类化合物的发酵培养基专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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