专利摘要

本发明涉及医药技术领域，具体是指从北极弯孢聚壳属真菌的次级代谢产物中提取的两种具有抗肿瘤活性的二萜类化合物libertellenoneG和libertellenoneH，化学结构式如下：本发明还提供了上述二萜类化合物的制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。CCTCCM20131442013.04.12

权利要求

1.二萜类化合物libertellenone G和libertellenone H，具有如下结构式：

2.一种如权利要求1所述的二萜类化合物libertellenone G和libertellenone H的制备方法，该方法包括如下步骤：

（A）从平板上挑取少量保藏号为CCTCC M2013144的弯孢聚壳菌D-1(Eutypella sp.D-1)的菌株的菌丝体，接种到装有PDB培养基的250mL三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装50—80mL的PDB培养基，20℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养5天后将种子培养液接种到2000mL的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装500mL PDB培养基，按1%—3%接种量接种，同上培养条件培养9天；

所述的PDB培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；

（B）将步骤（A）培养得到的菌液过滤，除去菌丝体后收集发酵液上清；将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复2—4次，合并萃取液蒸干溶剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为甲醇；

（C）将所得洗脱相蒸干后通过ODS反相柱层析纯化，流动相为：甲醇－水；收集90%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后继续过ODS反相柱层析，流动相为：甲醇－水；收集70%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后采用制备型薄层板获得化合物libertellenone G，收集85%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后采用制备型薄层板获得化合物libertellenone H。

3.如权利要求1所述的二萜类化合物libertellenone G和libertellenone H在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是指从北极弯孢聚壳属真菌的次级代谢产物中提取的两种具有抗肿瘤活性的二萜类化合物libertellenone G和libertellenone H，及其它们在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

由于极地特殊的气候环境，如低温、反复冻融和强辐射等，使得生存于此的微生物可能具有与温带，热带微生物不同的生理性状，并产生许多结构类型新颖，生物活性多样的次级代谢产物。随着从极地微生物代谢产物中发现大量结构独特、骨架新颖、活性显著的化合物，极地微生物次级代谢产物的研究已经逐渐成为国内外研究的热点。

真菌弯孢聚壳菌属（Eutypella sp.）的次级代谢产物目前研究的比较少，仅有部分报道，从已知的报道中可知，该种属的次级代谢产物主要包括聚酮类如γ-内酯，苯并吡喃衍生物，二萜，三萜以及含氮的化合物（细胞松弛素、环肽）等。在已报道的结构中，各类化合物都具有多样的生物活性，如抑制HIV病毒、抗肿瘤、抗菌等。

Libertellenone家族是一类从真菌中分离出来的二萜类的次级代谢产物，其结构母环属于海松烷型的三环二萜类，结构式如下所示，具有多羟基取代和高不饱和度的特点，是真菌次级代谢产物中一类重要的二萜类化合物。

海松烷型二萜母核

到目前为止得到了Libertellenone A-F六个该家族的化合物，结构式如下所示，经文献查阅，各化合物均显示出一定的抗肿瘤活性，见表1（参考文献：[1]Oh,D.Ch.;Jensen,P.R.;Kauffman,C.A.;Fenical W.Libertellenones A-D:Induction of cytotoxic diterpenoid biosynthesis by marine microbial competition.Bioorg.Med.Chem.2005,13,5267-73.；[2]Mariko,T.;Miyuki,F.;Kazuhiko,M.; Takeshi,S.;Toshihiro,S.;Kazuto,N.;Takashi,S.;Masahiro,I.;Kaoru,K.;Kunio,T.;Motoo,S.;Kiyotka,K.Chemical constituents of a marine fungus,Arthrinium sacchari.J.Nat.Prod.,2011,74,1645-9.；[3]Sun L.;Li D.L.;Tao M.H.;Chen Y.C.;Dan F.J.;Zhang W.M.Scopararanes C-G:new oxygenated pimarane diterpenes from the marine sediment-derived fungus Eutypella scoparia FS26.Mar.Drugs2012,10,539-50.）。

表1：libertellenone A-G的对各肿瘤细胞株的活性（IC₅₀，μM）

注：没有数据的是尚无文献报道该化合物对该类肿瘤细胞株的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于从极地微生物中，具体是从北极弯孢聚壳属真菌的次级代谢产物中提取得到新的二萜类化合物，本发明的另一目的在于提供这些化合物制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术方案如下：本发明所用的菌种是分离自北极 地区Kongsfjorden的伦敦岛（海拔100米）土壤样品的弯孢聚壳属真菌D-1(Eutypella sp.D-1)，于2013年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC M2013144。本发明从该弯孢聚壳属真菌D-1中分离获得两个具有抗肿瘤活性的新的天然产物，命名为libertellenone G和libertellenone H。

本发明的第一方面，是提供了二萜类化合物libertellenone G和libertellenone H，具有如下结构式：

libertellenone G，为黄色油状物，分子式C₂₀H₂₆O₃，分子量：314；高分辨质谱：315.1963(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表2。

libertellenone H，为黄色油状物，分子式C₂₆H₃₄O₇，分子量：458；高分辨质谱：459.2378(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表3。

本发明的第二方面，是提供了上述的二萜类化合物libertellenone G和libertellenone H的制备方法，该方法包括如下步骤：

（A）从平板上挑取少量保藏号为CCTCC M2013144的弯孢聚壳菌D-1(Eutypella sp.D-1)菌株的菌丝体，，接种到装有PDB培养基的250mL三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装50—80mL的PDB培养基，20℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养5天后将种子培养液接种到2000mL的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装500mL PDB培养基，按1%—3%接种量接种，同上培养条件培养9天；

所述的PDB培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

（B）将步骤（A）培养得到的菌液过滤，除去菌丝体后收集发酵液上清；将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复2—4次，合并萃取液蒸干溶剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为甲醇；

（C）将所得洗脱相蒸干后通过ODS反相柱层析纯化，流动相为：甲醇－水；收集90%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后继续过ODS反相柱层析，流动相为：甲醇－水；收集70%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后采用制备型薄层板获得化合物libertellenone G，收集85%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后采用制备型薄层板获得化合物libertellenone H。

本发明的第三方面，是提供了上述的二萜类化合物libertellenone G和 libertellenone H在制备抗肿瘤药物中的应用。

结果显示，libertellenone G和libertellenone H对大多数肿瘤细胞株都具有一定的抑制活性。libertellenone H对Mcf-7乳腺癌的抑制作用最强，IC₅₀达到了3.31μM，和阳性对照紫杉醇的IC₅₀相当。此外，libertellenone G和libertellenone H对各肿瘤细胞株的抑制作用，也优于文献报道的同类化合物的抑制活性。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：弯孢聚壳菌D-1（CCTCC M2013144）的发酵培养 

a.弯孢聚壳菌D-1(Eutypella sp.D-1)，于2013年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC M2013144；弯孢聚壳属真菌D-1的发酵培养基如下：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

b.发酵培养过程：将D-1从平板上挑取少量D-1菌株的菌丝体，接种到装有PDB培养基的250mL三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装70mL培养基，20℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养5天后将种子培养液接种到2000mL的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装500mL PDB培养基，按12%接种量接种，同上培养条件培养9d。

实施例2：活性化合物的分离提取

将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌丝体后收集发酵液上清。将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为甲醇。将所得洗脱相蒸干后通过ODS反相柱层析纯化，流动相为：甲醇－水，收集90%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后继续过ODS反相柱层析，流动相为：甲醇－水，收集70%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后采用制备型薄层板（HSGF254，烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂；烟台江友硅胶开发有限公司）获得化合物libertellenone G，收集85%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后采用制备型薄层板获得化合物libertellenone H。

libertellenone G，为黄色油状物，分子式C₂₀H₂₆O₃，分子量：314；高分辨质谱：315.1963(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表2。

libertellenone H，为黄色油状物，分子式C₂₆H₃₄O₇，分子量：458；高分辨质谱：459.2378(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表3。

表2：libertellenone G的¹H和¹³C核磁共振谱数据

表3：libertellenone H的¹H和¹³C核磁共振谱数据

采用600MHz的核磁共振仪测定，样品溶解于氘代氯仿。

同时，还测定了两个化合物的多种二维核磁共振谱（TOCSY，DQCOSY，HMQC，HMBC和NOESY），确定了化合物所有的碳原子和氢原子的归属及该化合物的化学结构，结构式如下：

实施例3：活性化合物libertellenone G和libertellenone H对人癌细胞株的抑制作用

方法：MTT法（Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods,1983,65,55-63.）：

分别取对数生长期人胶质瘤细胞株U251，人胰腺癌细胞株SW1990，人胃癌细胞株SG7901，人乳腺癌细胞株Mcf-7，人肝癌细胞株Huh-7，人子宫颈癌细胞株Hela，人肺癌细胞株H460，各以2×10⁴/孔细胞接种于96孔板上，分别加入不同浓度（1.5μg/ml—50μg/ml）的libertellenone G和libertellenone H，设0.1%DMSO对照组培养72h，结束前4h每孔加入5mg/mL MTT10μL，培养结束时离心并小心吸去上清液，加入200μL DMSO并轻微振荡，使生成的甲賛完全溶解显色后，用Bio-Rad Model550Microplate Reader以570nm波长测OD值。实验共进行3次，算出平均值。按下式计算抑制率：抑制率（%）=（1－实验组平均OD值／对照组平均OD值）×100%。用Bliss软件计算细胞生长抑制率达50%的libertellenone G和libertellenone H的浓度，以IC₅₀表示，结果如表4所示。

表4：具有抗肿瘤活性的libertellenone G和libertellenone H（IC₅₀，μM）

结果显示，libertellenone G和libertellenone H对大多数肿瘤细胞株都具有一定的抑制活性。libertellenone H对Mcf-7乳腺癌的抑制作用最强，IC₅₀达到了3.31μM，和阳性对照紫杉醇的IC₅₀相当。此外，libertellenone G和libertellenoneH对各肿瘤细胞株的抑制作用，也优于文献报道的同类化合物的抑制活性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

具有抗肿瘤活性的二萜类化合物libertellenoneG和libertellenoneH及其应用专利购买费用说明

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A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。