专利摘要

本发明公开了一种热带芽孢杆菌WZZ018及其应用，所述的应用为：以热带芽孢杆菌WZZ018经发酵培养获得的湿菌体或冷冻干燥后的冻干菌粉为催化剂，以外消旋5‑氯‑2,3‑二氢‑2‑羟基‑1‑氧代‑1H‑茚‑2‑羧酸甲酯为底物，以pH值5.0～10.0的缓冲液为反应介质，在20～45℃、100～300r/min条件下进行拆分；本发明提供的产酶微生物菌株‑‑热带芽孢杆菌WZZ018的区域选择性强，制备的产物对映体过量值最高可达93.72％，反应转化率高，酶反应条件温和、副产物少，环境污染小，是一种高效制备高纯度对映体的方法，适合工业化生产。

权利要求

1.热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)WZZ018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2019241，保藏日期2019年04月08日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

2.一种权利要求1所述热带芽孢杆菌WZZ018在拆分外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以热带芽孢杆菌WZZ018经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的冻干菌粉为催化剂，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，以pH值5.0～7.0的缓冲液为反应介质，在20～45℃、100～300r/min条件下反应完全后，转化液分离纯化，获得S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物初始浓度以缓冲液体积计为4.2～150mM，冻干菌粉加入量以缓冲液体积计为10～50g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：

(1)斜面培养：将热带芽孢杆菌WZZ018接种至斜面培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得斜面菌体；斜面培养基组成：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1g/L，琼脂粉15～20g/L，pH7.0，溶剂为去离子水；

(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1g/L，pH 7.0～7.2，溶剂为去离子水；

(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度1-2％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在12000rpm离心10min，弃上清液，收集湿菌体；湿菌体真空冷冻干燥，获得冻干菌粉；发酵培养基组成为：葡萄糖15g/L，牛肉膏15g/L，K2HPO4·3H2O 6g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，NaCl 0.5g/L，pH 6.5，溶剂为去离子水。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化液分离纯化的方法为：反应完毕后得到的转化液，12000rpm离心10min后上层溶液真空旋蒸至干，获得浓缩物；将浓缩物用二氯甲烷溶解，采用正相硅胶柱层析，用体积比1:3的乙酸乙酯：石油醚进行洗脱，流速8mL/min，TLC跟踪检测，收集Rf＝0.30的组分，减压浓缩至干，得产物S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种新菌株--热带芽孢杆菌WZZ0018及其在立体选择性拆分5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯反应生成光学纯S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用。

(二)背景技术

茚虫威(Indoxacard)，又名Avatar(安打)、Ammate(全垒打)、Avaunt Steward，是美国杜邦公司在1992年开发的新型氨基甲酸酯类杀虫剂，通过阻断昆虫神经细胞内的钠离子通道，使神经细胞失去功能，具有触杀胃毒作用，可用在果树、蔬菜和林木等农作物上，能够有效消灭鳞翅目害虫如棉铃虫、叶蛾等，同时对半翅目和蜱类也很有效，具有用量低、杀虫谱广、使用安全以及对人畜和天敌无伤害等特点，可克服和延缓害虫抗药性的产生，它还可以与甲维盐、哒嗪硫磷制成复配杀虫剂，其增效作用明显。茚虫威具有作用机理独特、高效广谱，是替代高毒、高残留及高抗性杀虫剂的理想药剂，市场及应用前景广阔，已在美国、澳大利亚、中国等国作为“降低风险产品”(reduced-risk product)登记注册。茚虫威的结构是一个复杂的噁二嗪化合物，含有的手性中心仅有一个，有R和S两种异构体，但研究表明仅S-异构体有活性，R-异构体没有活性。

S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯是制备茚虫威的关键手性中间体，该对映体过量值的高低直接影响最终产品的质量和杀虫剂活性，因此探索其合成工艺具有长远的应用意义，为新型杀虫剂在农业生产中的进一步应用提供理论和实践基础。迄今为止，合成S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的方法仅限化学法，由于原料和合成工艺的不同，获得的产品的光学纯度有很大的差异，目前，化学法制备获得的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的纯度为90％左右。

根据反应原料的不同，分为以下几种不同的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的化学制备方法。

(1)郭立湘以丙烯酸为原料，通过氢化、酰氯化和烷基化等一系列反应制得5-氯-2,3-二氢-1-茚酮，然后与碳酸二甲酯(DMC)和甲醇钠(NaH)缩合制得5-氯-1-氧代-2,3-二氢茚-2-羧酸甲酯，以辛可宁手性为催化剂，不对称羟基化合成S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚2-羧酸甲酯，其e.e值为89.4％，反应式如下：

(2)胡新根等以5-氯-2-甲氧羰基-1-茚酮(Ⅰ)为起始原料探讨了不同溶剂、氧化剂、催化剂等对反应收率和产品e.e值的影响，最优反应条件：n(Ⅰ)∶n(辛可宁)∶n(过氧化氢异丙苯)＝1∶0.2∶1.2，CH₂Cl₂作溶剂，室温反应5h后，制得光学纯度为92％的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯，反应式如下：

目前化学合成法虽然能够实现快速合成，但由于化学拆分法中存在着复杂的消旋竞争因素，很难得到光学纯度较高的单一对映异构体。其中，不对称羟基化反应步骤不仅需要大量的手性催化剂，而且要求在有机溶剂中催化过氧化物与5-氯-2,3-二氢-1-氧-1-茚酮-羧酸甲酯进行非对称性反应，化学反应剧烈，安全性差，对环境容易造成有机污染，不利于大规模工业生成。本发明的微生物酶法拆分制备光学纯度高的S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯，反应条件温和，污染少，符合环境可持续发展的要求。

(三)发明内容

本发明目的是为了解决上述方法的不足，通过筛选产酯水解酶微生物，提供了一种廉价高效的产酶微生物，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为反应底物，立体选择性水解制备光学纯S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明从土壤中筛选到对底物外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯具有高立体选择性的一株新菌株--热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)WZZ018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2019241，保藏日期2019年04月08日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明还提供一种所述热带芽孢杆菌WZZ018在不对称水解外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯中的应用，具体所述的应用为：以热带芽孢杆菌WZZ018经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的冻干菌粉为催化剂，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯为底物，以pH值5.0～10.0的缓冲液为反应介质，在20～45℃、100～300r/min条件下反应完全(优选20-40h)后，获得含S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的转化液，将转化液分离纯化，获得S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。所述底物初始浓度以缓冲液体积计为4.2～150mM(优选5-50mM，最优选20mM)，冻干菌粉加入量以缓冲液体积计为10-50g/L，优选50g/L。

进一步，所述反应条件优选为25-30℃、180r/min反应24h。

进一步，所述缓冲液优选为pH7.0的磷酸盐缓冲液。

本发明所述催化剂按如下方法制备：

(1)斜面培养：将热带芽孢杆菌WZZ018接种至斜面培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得斜面菌体；斜面培养基组成(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 1，琼脂粉15～20，pH7.0，溶剂为去离子水；

(2)种子培养：取斜面菌体接种于种子培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得种子液；种子培养基组成(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0～7.2，溶剂为去离子水；

(3)发酵培养：在无菌条件下，取种子液以体积浓度1-2％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液，取发酵液在10000rpm离心10min，弃上清液，收集湿菌体，用0.2M pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次，收集菌体在-40℃条件下真空冷冻干燥2天，获得冻干菌粉；发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖15，牛肉膏15，K₂HPO₄·3H₂O6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 1.0，NaCl 0.5，pH 6.5，溶剂为去离子水。

本发明所述转化液分离纯化的方法为：反应完毕后得到的转化液，12000rpm离心10min后，上层溶液用水循环泵真空旋蒸干燥，所得干燥样品用二氯甲烷溶解，硅胶(200～300目，国药集团化学试剂有限公司)拌样，采用正相硅胶柱层析(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913，200～300目)，用乙酸乙酯：石油醚＝1:3(体积比)洗脱，试管收集，流速8mL/min，TLC(薄层色谱法)检测，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：2(v/v)，收集R_f＝0.30的组分合并，合并液减压浓缩至干燥后，得产品S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯。

本发明有益效果主要体现在：本发明提供的产酶微生物菌株--热带芽孢杆菌WZZ018的区域选择性强，制备的产物对映体过量值最高可达93.72％。利用芽孢杆菌WZZ018立体选择性拆分外消旋底物，反应转化率可高达52.84％，能够将R构型底物水解制备成单一的S型异构体，且生物酶法制备S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的研究尚无报道。酶反应条件温和、副产物少，环境污染小，是一种可靠的和有效制备高纯度对映体产品的手段，适合工业化生产。

(四)附图说明

图1为外消旋体5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯的液相色谱图。

图2为实施例3微生物催化外消旋底物5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯制备S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯的液相色谱图。

图3本发明反应流程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1菌株WZZ018筛选及鉴定

1、立体选择性酯水解酶产生菌的筛选

菌种的初筛：称取湿土样1g(从浙江省杭州市浙江大学华家池校区试验田土壤中取得)混悬于10mL无菌生理盐水中，振荡混匀；接3mL混悬液于50mL含10mmol/L外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的液体富集培养基中，在30℃、180r/min下培养5～7d后，无菌操作转接1mL浑浊的菌液到新鲜的含10mmol/L外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯的液体富集培养基，连续富集3～4次。富集培养基中，以外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧-1H-茚-2-羧酸甲酯为唯一碳源，富集培养基配方如下：NaNO₃3.0g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，pH 7.0，溶剂为去离子水。将富集后菌液经梯度稀释，涂布分离平板培养基，多次分离，获取单菌落。分离平板培养基组成为：富集培养基加入琼脂20g/L，pH 7.0。

菌种的复筛：挑取单菌落接种于初始发酵培养基，30℃、180rpm条件下，培养24h。取10ml发酵液10000rpm离心10min，用pH 7.0的0.2M的磷酸盐缓冲液洗涤，12000rpm离心10min得到湿菌体。初始发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，牛肉膏3，K₂HPO₄·3H₂O6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 0.5，NaCl 0.5，pH 7.0，溶剂为去离子水。

水解反应：在2mL离心管中，加入950μL PB(pH7.0)缓冲液悬浮10ml发酵液离心后的湿菌体，然后加入20mM外消旋底物，以灭活菌液的反应组做空白对照，置于30℃，180rpm恒温水浴反应24h后，反应液离心，取上清液，用4M HCl调节pH为2，加入等体积(800μL)乙酸乙酯萃取，有机层取50μL，用真空旋蒸仪旋干，然后用1mL流动相溶解，通过HPLC检测菌体的立体选择性及酶催化水解活性，筛选得到底物的对映体过量值达到81.03％的微生物菌株，记为菌株WZZ018。

HPLC液相色谱分析条件：采用液相色谱仪Waters 1525型液相色谱仪；手性液相色谱柱 Cellud-Y(250×4.6m)；流动相为正己烷：异丙醇：乙醇＝16:8:1(体积比)，流速0.5mL/min，柱压370psi，柱温30℃；进样量10μL。(S)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯和(R)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-羧酸甲酯分别在18.83min和23.49min出峰(如图1所示)。

2、菌株WZZ018的鉴定

菌落形态：将筛选到的菌株WZZ018接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基(组成：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 1g/L，琼脂粉20g/L，pH7.0，溶剂为去离子水，pH7.0)，在30℃下，培养24h，菌落为灰白色，较大，表面粗糙，扁平，不规则，有芽孢。经革兰氏染色后，细胞呈紫色，表明该菌种WZZ018为革兰氏阳性菌。

生理生化特征：菌株WZZ018可利用75种碳源中大部分的碳源，不能利用蜜二糖、D-甘露糖、明胶、L-丙氨酸等，根据该菌株对不同碳源的利用能力，BIOLOG分析结果显示菌株与Bacillus sp.相似度最高，4-6h培养鉴定结果SIM值≥0.75是可以接受的结果；16-24h培养后读取结果时，SIM值≥0.5是可以接受的结果，因此判断该菌株为Bacillus sp.。

经测序鉴定，菌株WZZ018的16S rDNA序列全长为975bp，如SEQ ID NO.1所示：

AGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGT。

根据生理生化特性和分子生物学鉴定，该菌株WZZ018被鉴定为热带芽孢杆菌，命名为热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)WZZ018。该菌种现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2019241，保藏日期2019年04月08日。

实施例2：

热带芽孢杆菌WZZ018接种至斜面培养基，在30℃培养2天，获得斜面菌体。斜面培养基组成(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，Nacl 1，琼脂粉20，溶剂为去离子水，pH7.0。

取斜面菌体接种于50mL的种子培养基中，在30℃、180r/min培养24h，获得种子液。种子培养基组成(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，Nacl 1，溶剂为去离子水，pH7.0。

在无菌条件下，取种子液以体积浓度2％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液。发酵培养基配方为(g/L)：葡萄糖15，牛肉膏15，K₂HPO₄·3H₂O 6，KH₂PO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 1.0，NaCl 0.5，溶剂为去离子水，pH 6.5。取10mL发酵液在12000rpm离心10min，弃上清液，收集湿菌体，即为热带芽胞杆菌WZZ018湿菌体，经酶活测定，该湿菌体比酶活力达到最大为6.02U/L。此外，菌体表现出良好、稳定的对映体选择性，酶催化反应后未水解底物的e.e值接近90％。将湿菌体在-40℃条件下，冻干2天，得到冻干菌粉。

以底物的消耗量来定义菌体细胞的酶活力，一个酶活力单位定义为：30℃，pH7.0，每分钟催化水解1微摩尔(μmol)底物所需的酶量。用950μL，0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)悬浮10mL发酵液离心得到的菌体，加入20mM底物，30℃，180rpm条件下反应24h。反应结束后，加入200μL 4M的HCl酸化，然后加入800μL乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄除水后，取有机层50μL，用真空干燥后，加入1mL的流动相(同实施例1)溶解，HPLC检测菌体的立体选择性及催化水解活性。

实施例3：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.05g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度20mM的1mL pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，30℃、180rpm条件下反应24h后，反应液离心，取上清液，用4M HCl调节pH为2，然后用等体积乙酸乙酯萃取，取有机层50μL，真空干燥后，加入1mL流动相(同实施例1)溶解，通过实施例1的HPLC方法检测(图2)，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为50.55％，底物e.e.s可达91.01％。

实施例4：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.05g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度20mM的1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液，30℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为52.84％，底物e.e.s可达93.72％。

实施例5：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.05g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度20mM的1mL pH 9.0tris-Hcl缓冲液，30℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为48.69％，底物e.e.s可达91.32％。

实施例6：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.05g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度20mM的1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液，25℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为51.34％，底物e.e.s可达92.93％。

实施例7：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.05g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度4.2mM的1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液，30℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为52.88％，底物e.e.s可达93.43％。

实施例8：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.05g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度50mM的1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液，30℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为51.75％，底物e.e.s可达90.09％。

实施例9：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.05g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度150mM的1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液，30℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率仅为2.82％，底物e.e.s仅为3.49％。

实施例10：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.01g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度20mM的1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液，30℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为12.83％，底物e.e.s仅达23.19％。

实施例11：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉0.03g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度20mM的1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液，30℃、180rpm条件下，反应24h后，反应液离心，取上清液，采用实施例3方法分离提取，得到S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，转化率为51.14％，底物e.e.s可达89.86％。

实施例12：

取实施例2方法制备的热带芽孢杆菌WZZ018冻干菌粉10g，加入到含有外消旋5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯终浓度为20mM的200mL pH7.0磷酸缓冲液中，30℃、180rpm条件下，反应24h后，转化反应结束后得到的转化液，12000rpm离心10min后上层溶液用水循环泵旋蒸干燥，所得样品1.61g用10mL二氯甲烷溶解，3g硅胶(200～300目，国药集团化学试剂有限公司)拌样，采用正相硅胶柱层析(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913，200～300目，50g)，用400mL乙酸乙酯：石油醚＝1:3(体积比)的洗脱液洗脱。试管收集，流速8mL/min，每管收集15mL，TLC(薄层色谱法)检测，展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：2(v/v)，收集Rf＝0.30的组分合并，合并液减压浓缩至干，经实施例1HPLC液相色谱分析，得产品S-(+)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1H-茚-2-羧酸甲酯，称重后为0.93g，得率为58％，纯度为96％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 热带芽孢杆菌WZZ018及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 975

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

agagcttgct cttatgaagt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca 60

taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt gaaccgcatg 120

gttcgaaatt gaaaggcggc ttcggctgtc acttatggat ggacccgcgt cgcattagct 180

agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg 240

gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 300

cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt 360

aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtgc tagttgaata agctggcacc ttgacggtac 420

ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 480

cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggtgg tttcttaagt ctgatgtgaa 540

agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactggga gacttgagtg cagaagagga 600

aagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagagata tggaggaaca ccagtggcga 660

aggcgacttt ctggtctgta actgacactg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 720

tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc 780

ctttagtgct gaagttaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 840

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900

aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa ccctagagat agggcttctc 960

cttcgggagc agagt 975

热带芽孢杆菌WZZ018及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。