专利摘要

本发明公开了一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法。该方法包括生物柴油副产物的纯化，纯化后甘油的纯度达到63.8％(w/w)；也包括以纯化后甘油为原料制备金合欢烯的重组宿主细胞的构建，该重组宿主细胞包含甲羟戊酸途径或者脱氧木酮糖‑5‑磷酸途径中的相关基因，异戊烯焦磷酸异构酶基因，金合欢烯焦磷酸合成酶基因和金合欢烯合成酶基因，且包括以纯化后甘油为原料在重组宿主细胞中发酵制备金合欢烯，所得金合欢烯的浓度为0.025g/L；还包括以纯化后甘油为原料优化构建可提高金合欢烯产量的重组宿主细胞，所得金合欢烯浓度达到2.9g/L，比优化前金合欢烯的浓度提高115倍。

权利要求

1.一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，其特征在于包括步骤如下：

(1)构建合成金合欢烯的重组宿主细胞：

构建三种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒，包括33-pMvaE-S、4-pEEM和28a-FII；所述的重组质粒33-pMvaE-S含有两个基因，包括MvaE酶基因和MvaS酶基因，其araC启动子所携带的外源基因碱基数为3564bp；所述的MvaE酶基因和MvaS酶基因选自粪肠球菌；所述的MvaE酶基因的DNA序列为seq.23；所述MvaS酶基因的DNA序列为seq.24；所述的araC启动子序列为seq.1；所述的重组质粒4-pEEM含有三个基因，包括甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因，其T7启动子所携带的外源基因碱基数为3879bp；所述的甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因选自酿酒酵母；所述的甲羟戊酸激酶基因的DNA序列为seq.20；所述的磷酸甲羟戊酸激酶基因的DNA序列为seq.21；所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的DNA序列为seq.22；所述的T7启动子序列为seq.7；所述的重组质粒28a-FII含有三个基因，包括金合欢烯合成酶基因、金合欢烯焦磷酸合成酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因，其T7启动子所携带的外源基因碱基数为3174bp；所述的金合欢烯合成酶基因选自青蒿素cDNA序列；所述的异戊烯焦磷酸异构酶基因，金合欢烯焦磷酸合成酶基因选自大肠杆菌；所述的金合欢烯合成酶基因的DNA序列为seq.25；所述的异戊烯焦磷酸异构酶基因的DNA序列为seq.16；所述的异戊烯焦磷酸异构酶基因的DNA序列为seq.17；所述的三种重组质粒携带外源基因的碱基数均在3000-4000bp范围内，均在启动子araC和T7转录能力的范围内；所述的三种重组质粒转化导入宿主细胞中获得合成金合欢烯的重组宿主细胞F3；

(2)将重组宿主细胞F3接种到含有纯化后生物柴油副产物的培养基中进行异源诱导表达金合欢烯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主细胞是大肠杆菌；所述的大肠杆菌是大肠杆菌DH5a。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的重组质粒33-pMvaE-S是将MvaE酶基因和MvaS酶基因通过pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建至常用空载质粒pBAD-33所得的；所述的重组质粒4-pEEM是将甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因通过pEASY-Uni Seamless Cloning and AssemblyKi技术手段构建至常用空载质粒pBBR1MCS-4所得的；所述的重组质粒28a-FII是将金合欢烯合成酶基因、金合欢烯焦磷酸合成酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因通过pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建至常用空载质粒pET-28a所得的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纯化的方法如下：

a.通过离心除去生物柴油副产物中的不溶性物质；

b.通过蒸馏方法除去生物柴油副产物中的甲醇；

c.通过加入磷酸中和已除去甲醇的生物柴油副产物，离心分离，获得纯化后生物柴油副产物，用于金合欢烯制备。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的生物柴油副产物的主要成分包括20％～50％的甘油、10％～35％的甲醇、碱性催化剂和5％～30％的皂；所述的离心条件是离心转速3000～15000rpm，离心时间5～60min；所述的磷酸浓度为5～60％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养基是每升培养基中含有1～100g纯化后生物柴油副产物、1～50g酵母粉、1～50g蛋白胨、1～30g无机盐、1～1000mg氯霉素、1～1000mg氨苄青霉素和1～1000mg卡那霉素；所述的异源诱导表达，其过程是加入0.1～10％重组宿主细胞种子液后，在30～45℃，50～350rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，往每升发酵液中添加1～10000mg L-阿拉伯糖诱导剂，1～10000mg异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂，和50～1000mL萃取剂，在16～35℃，50～350rpm条件下进行异源诱导表达；所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷或煤油。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的重组宿主细胞种子液制备方法如下：重组宿主细胞F3接种于LB培养基，在30℃，200rpm条件下培养12h后，获得重组宿主细胞种子液；所述的LB培养基含有10g蛋白胨，5g酵母膏和10g NaCl。

说明书

技术领域

本发明描述了一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，包括生物柴油副产物的纯化，也包括以纯化后甘油为原料生产金合欢烯的重组宿主细胞的构建，且包括以纯化后甘油为原料在重组宿主细胞中发酵制备金合欢烯，还包括以纯化后甘油为底物提高产金合欢烯能力的重组宿主细胞的构建并高产金合欢烯。

背景技术

近年来，随着能源紧缺，以及环境的恶化，生物柴油作为一种极有发展前景的生物能源，其规模化发展不断扩大。与此同时，生物柴油副产物也日益增多，远大于传统的生物柴油副产物回收利用的市场需求。因此，对生物柴油生产过程中廉价生物柴油副产物的有效利用成为一个严峻的问题。大力开发和利用生物柴油副产物可以降低生物柴油的制备成本，提高生物柴油的市场竞争力，减少环境污染。其中，通过微生物发酵可以利用生物柴油副产物生产高附加值产品，可以解决生物柴油副产物对环境的污染，是提高生物柴油产业经济效益的途径之一。

第一代生物燃料，特别是乙醇和生物柴油(即脂肪酸甲基酯)受到了很多的限制，如与汽油混合比例的限制，以及在低温条件下较差的表现能力。而金合欢烯，可氢化为金合欢烷，是一种可再生、可与石化柴油和航天燃料混合使用的燃料，克服了第一代生物燃料的缺点。金合欢烷具有不含硫和微粒、高十六烷值、低温性能和低GHG排放的优点，是一种应用广泛且效果理想的可再生燃料。目前，Amyris公司利用自己的专利菌株将蔗糖(来源于甘蔗)发酵生成金合欢烯。但是，甘蔗属于食品级原料，价格相对昂贵，不利于持续性规模化生产。若能将生物柴油副产物作为原料来发酵生产金合欢烯，将解决原料来源的限制，还能解决生物柴油副产物污染环境的问题，而且可大幅降低生产成本。针对于此，本发明提供了以生物柴油副产物为原料制备金合欢烯的重组宿主细胞及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法(图1)。该方法包括生物柴油副产物的纯化，也包括以纯化后甘油为原料生产金合欢烯的重组宿主细胞的构建，且包括以纯化后甘油为原料在重组宿主细胞中发酵制备金合欢烯，还包括以纯化后甘油为底物提高产金合欢烯能力的重组宿主细胞的构建并高产金合欢烯。

一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，包括步骤如下：

(1)生物柴油副产物的纯化：

a.通过离心除去生物柴油副产物中的不溶性物质；

b.通过蒸馏方法除去生物柴油副产物中的甲醇；

c.通过加入磷酸中和已除去甲醇的生物柴油副产物，离心分离，获得纯化后甘油，用于金合欢烯制备；

(2)以生物柴油副产物为原料生产金合欢烯的重组宿主细胞的构建：

a.通过NCBI数据库查询和基因工程技术手段获得合成金合欢烯的相关基因，包括甲羟戊酸(MVA)途径或者脱氧木酮糖-5-磷酸(MEP)途径中的基因，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI)，金合欢烯焦磷酸合成酶基因(ispA)和金合欢烯合成酶基因(FG)；

b.构建多种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒，所述的多种重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共同表达合成金合欢烯的相关蛋白；

c.多种重组质粒转化导入宿主细胞中获得合成金合欢烯的重组宿主细胞。

(3)将上述所述的重组宿主细胞接种到含有上述所述的纯化后甘油的培养基中进行异源诱导表达制备金合欢烯。

(4)以上述所述的纯化后甘油为底物构建可提高金合欢烯产量的重组宿主细胞：

a.根据多种重组质粒的启动子的转录能力，优化相应启动子携带基因的种类和个数，多种已优化的重组质粒共同表达合成金合欢烯的相关蛋白，并平衡代谢路径中各个基因的蛋白表达水平；

b.将多种已优化的重组质粒转化导入宿主细胞中获得提高金合欢烯产量的重组宿主细胞；

c.将上述所述的重组宿主细胞接种到含有上述所述的纯化后甘油的培养基中进行异源诱导表达高产金合欢烯。

所述的生物柴油副产物的主要成分包括20％～50％的甘油、10％～35％的甲醇、碱性催化剂和5％～30％的皂；所述的离心条件是离心转速3000～15000rpm，离心时间5～60min；所述的磷酸浓度为5～60％。

所述的MVA途径包括乙酰乙酰基CoA硫解酶(atoB)、HMG-CoA合酶(HMGS)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(E12)、磷酸甲羟戊酸激酶(E8)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)；所述的MVA途径或包括MvaE酶和MvaS酶，其中，MvaE酶具有乙酰乙酰基CoA硫解酶酶活性，MvaS酶具有HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶的双酶活性；所述的MEP途径包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(IspC)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖-2，4-环二磷酸合成酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG)和异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶(ispH)；所述的FG选自青蒿素、苹果皮、甜橙、玫瑰、依兰花或者橘子皮等植物金合欢烯合成酶cDNA序列。

所述的宿主细胞是原核细胞；所述的启动子在原核细胞中有转录能力；所述的启动子选自araC启动子(Seq.1)，lac启动子(Seq.2)，tac启动子(Seq.3)，trc启动子(Seq.4)，T3启动子(Seq.5)，T5启动子(Seq.6)和T7启动子(Seq.7)。

所述的培养基是每升培养基中含有1～100g纯化后甘油、1～50g酵母粉、1～50g蛋白胨、1～30g无机盐、1～1000mg一种或者多种抗生素；所述的异源诱导表达，其过程是加入0.1～10％重组宿主细胞种子液后，在30～45℃，50～350rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，往每升发酵液中添加1～10000mg一种或多种诱导剂，和50～1000mL萃取剂，在16～35℃，50～350rpm条件下进行异源诱导表达，异源诱导表达时间为3～120h；所述的抗生素选自氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素或者阿奇霉素；所述的诱导剂选自L-阿拉伯糖或IPTG；所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷或煤油。

所述的多种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒是33-pMevT、4-pMBIS和28a-FG；所述的重组质粒33-pMevT的启动子是araC启动子；所述的重组质粒33-pMevT含有三种基因，包括atoB、HMGS和HMGR；所述的重组质粒4-pMBIS和28a-FG的启动子都是T7启动子；所述的重组质粒4-pMBIS含有五个基因，包括E12、E8、MVD1、IDI和ispA；所述的重组质粒28a-FG含有FG；

所述的多种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒是33-pMvaE-S、4-pMBIS和28a-FG；所述的重组质粒33-pMvaE-S的启动子是araC启动子；所述的重组质粒33-pMvaE-S含有两个基因，包括MvaE酶基因和MvaS酶基因；

所述的多种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒是33-pDCDE、4-pFGHII和28a-FG；所述的重组质粒33-pDCDE的启动子是araC启动子；所述的重组质粒33-pDCDE含有四个基因，包括DXS、IspC、IspD和IspE；所述的重组质粒4-pFGHII的启动子是T7启动子；所述的重组质粒4-pFGHII含有五个基因，包括IspF、IspG、IspH、IDI和ispA。

所述的多种重组质粒的启动子的转录能力为0～4500bp；所述的基因种类为合成金合欢烯的相关基因；所述的基因个数为1～9。

优选的，所述的磷酸浓度为40％；优选的，所述的离心转速7000rpm，离心时间20min；优选的，所述的纯化后甘油的纯度为63.8％(w/w).

优选的，所述的atoB(Seq.8)、DXS(Seq.9)、IspC(Seq.10)、IspD(Seq.11)、IspE(Seq.12)、IspF(Seq.13)、IspG(Seq.14)、ispH(Seq.15)、IDI(Seq.16)和ipsA(Seq.17)的DNA序列选自大肠杆菌；优选的，所述的HMGS(Seq.18)、HMGR(Seq.19)、E12(Seq.20)、E8(Seq.21)和MVD1(Seq.22)的DNA序列选自酿酒酵母；优选的，所述的MvaE(Seq.23)和MvaS(Seq.24)的DNA序列选自粪肠球菌；优选的，所述的FG选自青蒿素cDNA序列(Seq.25)。

优选的，所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)；优选的，所述的多种重组质粒是33-pMvaE-S、4-pMBIS和28a-FG；优选的，所述的重组宿主细胞含有多种重组质粒33-pMvaE-S、4-pMBIS和28a-FG；优选的，所述的每升培养基配方是23.5g纯化后甘油，10g酵母粉，16g蛋白胨，5g NaCl，34mg氯霉素，50mg卡娜霉素和100mg氨苄青霉素；优选的，所述的异源诱导表达，其过程是加入1％重组宿主细胞F1种子液后，在37℃，220rpm条件下培养至OD600在0.6～0.8之间，向每升发酵液中添加24mg IPTG、3g L-阿拉伯糖和200mL正癸烷，在30℃，220rpm条件下进行异源诱导表达；优选的异源诱导表达时间为96h，金合欢烯浓度为0.025g/L。

优选的，所述的araC启动子和T7启动子的转录能力范围为3000～4000bp；优选的，所述的多种已优化的重组质粒是33-pMvaE-S、4-pEEM和28a-FII；所述的重组质粒33-pMvaE-S含有两个基因MvaE和MvaS，其araC启动子所携带的外源基因碱基数为3568bp；所述的重组质粒4-pEEM含有三个基因E12、E8和MVD1，其T7启动子所携带的外源基因碱基数为3897bp；所述的重组质粒28a-FII含有三个基因FG、ispA和IDI，其T7启动子所携带的外源基因碱基数为3174bp；优选的，所述的已优化重组宿主细胞含有多种已优化的重组质粒33-pMvaE-S、4-pEEM和28a-FII。

优选的，所述的每升培养基配方是23.5g纯化后甘油，10g酵母粉，16g蛋白胨，5gNaCl，34mg氯霉素，50mg卡娜霉素和100mg氨苄青霉素；所述的异源诱导表达，其过程是加入1％重组宿主细胞F3种子液后，在37℃，220rpm条件下培养至OD600在0.6～0.8之间，向每升发酵液中添加24mg IPTG、3g L-阿拉伯糖和200mL正癸烷，在30℃，220rpm条件下进行异源诱导表达；优选的，所述的已优化的重组宿主细胞产金合欢烯，发酵96h，金合欢烯达到2.9g/L，比未优化的重组宿主细胞高115倍。

本发明公开的一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，与现有技术相比具有以下优点：

(1)以生物柴油副产物作为原料制备金合欢烯，扩大了生产金合欢烯的原料选择，有利于持续性规模化生产；

(2)生物柴油副产物的利用，可解决生物柴油副产物对环境污染的问题；

(3)生物柴油副产物来源丰富，价格便宜，可以大幅降低生产成本；

(4)本发明所述的提高产金合欢烯能力的方法，与传统基因工程手段相比，可以快速简便地调控代谢路径各个基因的转录水平，从而调控代谢路径的表达通量，提高金合欢烯的分泌合成能力，而且该方法具有普适性，可以应用于其他代谢路径通量表达的提高。

附图说明

图1利用生物柴油副产物生产金合欢烯的代谢路径图；

图2构建携带MVA代谢途径的重组宿主细胞F1；

图3以纯化后甘油为原料利用重组宿主细胞F1发酵生产金合欢烯的细胞密度(■)和金合欢烯(●)动力学曲线；

图4构建携带MEP代谢途径的重组宿主细胞F2；

图5以纯化后甘油为原料利用重组宿主细胞F2发酵生产金合欢烯的细胞密度(■)和金合欢烯(●)动力学曲线；

图6构建提高产金合欢烯能力的重组宿主细胞F3(MVA途径)；

图7以纯化后甘油为原料利用重组宿主细胞F3发酵生产金合欢烯的细胞密度(■)和金合欢烯(●)动力学曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1

生物柴油副产物纯化

初始生物柴油副产物通过3000rpm离心5min，除去不溶性物质；经过蒸馏(温度控制在65℃左右)除去部分甲醇，再加入5％磷酸中和，离心离获得纯化后甘油，甘油浓度为33.4％(w/w)，用于金合欢烯的制备。

重组宿主细胞F1的构建

根据表1引物，以大肠杆菌和酿酒酵母组DNA为模板，通过PCR扩增获得MVA途径所有酶(除金合欢烯合成酶外)的相应DNA序列。金合欢烯合成酶cDNA序列选自青蒿素该酶cDNA序列，通过基因合成方式获得该基因DNA序列。根据上述获得的DNA序列通过pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建如图2所示的三种重组质粒。选用大肠杆菌DH5a为宿主细胞，根据图2所示，通过CaCl2转化法转入重组质粒33-pMevT、4-pMBIS和28a-FG获得重组宿主细胞F1，其中，重组质粒33-pMevT含有araC启动子(Seq.1)、atoB(Seq.8)、HMGS(Seq.18)和HMGR(Seq.19)，重组质粒4-pMBIS含有T5启动子(Seq.6)、E12(Seq.20)、E8(Seq.21)、MVD1(Seq.22)、IDI(Seq.16)和ipsA(Seq.17)，重组质粒28a-FG含有lac启动子(Seq.2)和FG(Seq.25)。

以纯化后甘油为底物利用重组宿主细胞F1发酵制备金合欢烯

重组宿主细胞F1接种于LB培养基(每升发酵液含有10g蛋白胨，5g酵母膏和10gNaCl)，在30℃，50rpm条件下培养24h后作为种子液。按照每升发酵液含有1g蛋白胨，1g酵母膏和1g NaCl的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)。纯化后甘油在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加0.1g已灭菌后甘油纯化产物，0.1mL种子液，3ul浓度为34g/L的氯霉素溶液，2ul浓度为50g/L的卡娜霉素溶液和1ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在30℃，50rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加5ul浓度为24g/L的IPTG溶液、10uL浓度为500g/L的L-阿拉伯糖溶液和5mL正己烷，在16℃，50rpm条件下进行诱导表达。每3h取1mL发酵液和100ul正己烷分别进行细胞密度和金合欢烯浓度的检测。实验结果如图3所示。发酵24h的实验结果如下：细胞密度OD600为3.83，金合欢烯浓度为2.46mg/L。

表1通过PCR获得MVA代谢途径中的基因所需引物

实施例2

生物柴油副产物纯化

初始生物柴油副产物通过15000rpm离心60min，除去不溶性物质；经过蒸馏(温度控制在65℃左右)除去部分甲醇，再加入60％磷酸中和，离心离获得纯化后甘油，甘油浓度为65.7％(w/w)，用于金合欢烯的制备。

重组宿主细胞F2的构建

根据表2引物，以大肠杆菌DNA为模板，通过PCR扩增获得MVA途径所有酶(除金合欢烯合成酶外)的相应DNA序列。金合欢烯合成酶cDNA序列选自青蒿素该酶cDNA序列，通过基因合成方式获得该基因DNA序列。根据上述获得的DNA序列通过pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Ki技术手段构建如图4所示的三种重组质粒。选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，根据图4所示，通过CaCl2转化法转入重组质粒33-pDCDE、4-pFGHII和28a-FG获得重组宿主细胞F2，其中，重组质粒33-pDCDE含有araC启动子、DXS(Seq.9)、IspC(Seq.10)、IspD(Seq.11)和IspE(Seq.12)，重组质粒4-pFGHII含有tac启动子(Seq.3)、IspF(Seq.13)、IspG(Seq.14)、ispH(Seq.15)、IDI(Seq.16)和ipsA(Seq.17)，重组质粒28a-FG含有T3启动子(Seq.5)和FG(Seq.25)。

以纯化后甘油为底物利用重组宿主细胞F2发酵制备金合欢烯

重组宿主细胞F2接种于LB培养基(每升发酵液含有10g蛋白胨，5g酵母膏和10gNaCl)，在37℃，220rpm条件下过夜培养后作为种子液。按照每升发酵液含有50g蛋白胨，50g酵母膏和30g NaCl的配方，配制240mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)。纯化后甘油在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加10g已灭菌后甘油纯化产物，10mL种子液，300ul浓度为34g/L的氯霉素溶液，200ul浓度为50g/L的卡娜霉素溶液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在45℃，350rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加50ul浓度为24g/L的IPTG溶液、1mL浓度为500g/L的L-阿拉伯糖溶液和100mL十二烷，在35℃，350rpm条件下进行诱导表达。每24h取1mL发酵液和100ul十二烷分别进行细胞密度和金合欢烯浓度的检测。实验结果如图5所示。发酵96h的实验结果如下：细胞密度OD600为8.83，金合欢烯浓度为0.025g/L。

表2通过PCR获得MEP代谢路径中的基因所需的引物

实施例3

生物柴油副产物纯化

初始生物柴油副产物通过7000rpm离心20min，除去不溶性物质；经过蒸馏(温度控制在65℃左右)除去部分甲醇，再加入40％磷酸中和，离心离获得纯化后甘油，甘油浓度为63.8％(w/w)，用于金合欢烯的制备。

重组宿主细胞F3的构建

根据表1引物，以大肠杆菌和粪肠球菌组DNA为模板，通过PCR扩增获得MVA途径所有酶(除金合欢烯合成酶外)的相应DNA序列。金合欢烯合成酶cDNA序列选自青蒿素该酶cDNA序列，通过基因合成方式获得该基因DNA序列。根据上述获得的DNA序列通过pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建如图6所示的三种重组质粒。选用大肠杆菌DH5a为宿主细胞，根据图6所示，通过CaCl2转化法转入重组质粒33-pMvaE-S、4-pEEM和28a-FII获得重组宿主细胞F3，其中，重组质粒33-pMvaE-S含有araC启动子(Seq.1)、MvaE(Seq.23)和MvaS(Seq.24)，重组质粒4-pMBIS含有T7启动子(Seq.6)、E12(Seq.20)、E8(Seq.21)和MVD1(Seq.22)，重组质粒28a-FG含有T7启动子(Seq.2)、FG(Seq.25)、IDI(Seq.16)和ipsA(Seq.17)。

以纯化后甘油为底物利用重组宿主细胞F3发酵制备金合欢烯

重组宿主细胞F3接种于LB培养基(每升发酵液含有10g蛋白胨，5g酵母膏和10gNaCl)，在30℃，50rpm条件下培养24h后作为种子液。按照每升发酵液含有16g蛋白胨，10g酵母膏和5g NaCl的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)。纯化后甘油在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加3.75g已灭菌后甘油纯化产物，1mL种子液，100ul浓度为34g/L的氯霉素溶液，100ul浓度为50g/L的卡娜霉素溶液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在37℃，220rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加100ul浓度为24g/L的IPTG溶液、0.6mL浓度为500g/L的L-阿拉伯糖溶液和20mL正癸烷，在30℃，220rpm条件下进行诱导表达。每24h取1mL发酵液和100ul正癸烷分别进行细胞密度和金合欢烯浓度的检测。实验结果如图7所示。发酵96h的实验结果如下：细胞密度OD600为16.48，金合欢烯浓度为2.92g/L。

Sequence Listing

Seq. 1

TGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTG

Seq. 2

ACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAA

Seq. 3

GACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGT

Seq. 4

TGACAATTAATCATCCGGCTCGT

Seq. 5

CCTTTAGTGAGGGTTAATT

Seq. 6

GAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGT

Seq. 7

TAATACGACTCACTATA

Seq. 8

ATGAAAAATTGTGTCATCGTCAGTGCGGTACGTACTGCTATCGGTAGTTTTAACGGTTCACTCGCTTCCACCAGCGCCATCGACCTGGGGGCGACAGTAATTAAAGCCGCCATTGAACGTGCAAAAATCGATTCACAACACGTTGATGAAGTGATTATGGGTAACGTGTTACAAGCCGGGCTGGGGCAAAATCCGGCGCGTCAGGCACTGTTAAAAAGCGGGCTGGCAGAAACGGTGTGCGGATTCACGGTCAATAAAGTATGTGGTTCGGGTCTTAAAAGTGTGGCGCTTGCCGCCCAGGCCATTCAGGCAGGTCAGGCGCAGAGCATTGTGGCGGGGGGTATGGAAAATATGAGTTTAGCCCCCTACTTACTCGATGCAAAAGCACGCTCTGGTTATCGTCTTGGAGACGGACAGGTTTATGACGTAATCCTGCGCGATGGCCTGATGTGCGCCACCCATGGTTATCATATGGGGATTACCGCCGAAAACGTGGCTAAAGAGTACGGAATTACCCGTGAAATGCAGGATGAACTGGCGCTACATTCACAGCGTAAAGCGGCAGCCGCAATTGAGTCCGGTGCTTTTACAGCCGAAATCGTCCCGGTAAATGTTGTCACTCGAAAGAAAACCTTCGTCTTCAGTCAAGACGAATTCCCGAAAGCGAATTCAACGGCTGAAGCGTTAGGTGCATTGCGCCCGGCCTTCGATAAAGCAGGAACAGTCACCGCTGGGAACGCGTCTGGTATTAACGACGGTGCTGCCGCTCTGGTGATTATGGAAGAATCTGCGGCGCTGGCAGCAGGCCTTACCCCCCTGGCTCGCATTAAAAGTTATGCCAGCGGTGGCGTGCCCCCCGCATTGATGGGTATGGGGCCAGTACCTGCCACGCAAAAAGCGTTACAACTGGCGGGGCTGCAACTGGCGGATATTGATCTCATTGAGGCTAATGAAGCATTTGCTGCACAGTTCCTTGCCGTTGGGAAAAACCTGGGCTTTGATTCTGAGAAAGTGAATGTCAACGGCGGGGCCATCGCGCTCGGGCATCCTATCGGTGCCAGTGGTGCTCGTATTCTGGTCACACTATTACATGCCATGCAGGCACGCGATAAAACGCTGGGGCTGGCAACACTGTGCATTGGCGGCGGTCAGGGAATTGCGATGGTGATTGAACGGTTGAATTAA

Seq. 9

ATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGCACTGGTCGACTCCACCCAGGAGTTACGACTGTTGCCGAAAGAGAGTTTACCGAAACTCTGCGACGAACTGCGCCGCTATTTACTCGACAGCGTGAGCCGTTCCAGCGGGCACTTCGCCTCCGGGCTGGGCACGGTCGAACTGACCGTGGCGCTGCACTATGTCTACAACACCCCGTTTGACCAATTGATTTGGGATGTGGGGCATCAGGCTTATCCGCATAAAATTTTGACCGGACGCCGCGACAAAATCGGCACCATCCGTCAGAAAGGCGGTCTGCACCCGTTCCCGTGGCGCGGCGAAAGCGAATATGACGTATTAAGCGTCGGGCATTCATCAACCTCCATCAGTGCCGGAATTGGTATTGCGGTTGCTGCCGAAAAAGAAGGCAAAAATCGCCGCACCGTCTGTGTCATTGGCGATGGCGCGATTACCGCAGGCATGGCGTTTGAAGCGATGAATCACGCGGGCGATATCCGTCCTGATATGCTGGTGATTCTCAACGACAATGAAATGTCGATTTCCGAAAATGTCGGCGCGCTCAACAACCATCTGGCACAGCTGCTTTCCGGTAAGCTTTACTCTTCACTGCGCGAAGGCGGGAAAAAAGTTTTCTCTGGCGTGCCGCCAATTAAAGAGCTGCTCAAACGCACCGAAGAACATATTAAAGGCATGGTAGTGCCTGGCACGTTGTTTGAAGAGCTGGGCTTTAACTACATCGGCCCGGTGGACGGTCACGATGTGCTGGGGCTTATCACCACGCTAAAGAACATGCGCGACCTGAAAGGCCCGCAGTTCCTGCATATCATGACCAAAAAAGGTCGTGGTTATGAACCGGCAGAAAAAGACCCGATCACTTTCCACGCCGTGCCTAAATTTGATCCCTCCAGCGGTTGTTTGCCGAAAAGTAGCGGCGGTTTGCCGAGCTATTCAAAAATCTTTGGCGACTGGTTGTGCGAAACGGCAGCGAAAGACAACAAGCTGATGGCGATTACTCCGGCGATGCGTGAAGGTTCCGGCATGGTCGAGTTTTCACGTAAATTCCCGGATCGCTACTTCGACGTGGCAATTGCCGAGCAACACGCGGTGACCTTTGCTGCGGGTCTGGCGATTGGTGGGTACAAACCCATTGTCGCGATTTACTCCACTTTCCTGCAACGCGCCTATGATCAGGTGCTGCATGACGTGGCGATTCAAAAGCTTCCGGTCCTGTTCGCCATCGACCGCGCGGGCATTGTTGGTGCTGACGGTCAAACCCATCAGGGTGCTTTTGATCTCTCTTACCTGCGCTGCATACCGGAAATGGTCATTATGACCCCGAGCGATGAAAACGAATGTCGCCAGATGCTCTATACCGGCTATCACTATAACGATGGCCCGTCAGCGGTGCGCTACCCGCGTGGCAACGCGGTCGGCGTGGAACTGACGCCGCTGGAAAAACTACCAATTGGCAAAGGCATTGTGAAGCGTCGTGGCGAGAAACTGGCGATCCTTAACTTTGGTACGCTGATGCCAGAAGCGGCGAAAGTCGCCGAATCGCTGAACGCCACGCTGGTCGATATGCGTTTTGTGAAACCGCTTGATGAAGCGTTAATTCTGGAAATGGCCGCCAGCCATGAAGCGCTGGTCACCGTAGAAGAAAACGCCATTATGGGCGGCGCAGGCAGCGGCGTGAACGAAGTGCTGATGGCCCATCGTAAACCAGTACCCGTGCTGAACATTGGCCTGCCGGACTTCTTTATTCCGCAAGGAACTCAGGAAGAAATGCGCGCCGAACTCGGCCTCGATGCCGCTGGTATGGAAGCCAAAATCAAGGCCTGGCTGGCATAA

Seq. 10

ATGAAGCAACTCACCATTCTGGGCTCGACCGGCTCGATTGGTTGCAGCACGCTGGACGTGGTGCGCCATAATCCCGAACACTTCCGCGTAGTTGCGCTGGTGGCAGGCAAAAATGTCACTCGCATGGTAGAACAGTGCCTGGAATTCTCTCCCCGCTATGCCGTAATGGACGATGAAGCGAGTGCGAAACTTCTTAAAACGATGCTACAGCAACAGGGTAGCCGCACCGAAGTCTTAAGTGGGCAACAAGCCGCTTGCGATATGGCAGCGCTTGAGGATGTTGATCAGGTGATGGCAGCCATTGTTGGCGCTGCTGGGCTGTTACCTACGCTTGCTGCGATCCGCGCGGGTAAAACCATTTTGCTGGCCAATAAAGAATCACTGGTTACCTGCGGACGTCTGTTTATGGACGCCGTAAAGCAGAGCAAAGCGCAATTGTTACCGGTCGATAGCGAACATAACGCCATTTTTCAGAGTTTACCGCAACCTATCCAGCATAATCTGGGATACGCTGACCTTGAGCAAAATGGCGTGGTGTCCATTTTACTTACCGGGTCTGGTGGCCCTTTCCGTGAGACGCCATTGCGCGATTTGGCAACAATGACGCCGGATCAAGCCTGCCGTCATCCGAACTGGTCGATGGGGCGTAAAATTTCTGTCGATTCGGCTACCATGATGAACAAAGGTCTGGAATACATTGAAGCGCGTTGGCTGTTTAACGCCAGCGCCAGCCAGATGGAAGTGCTGATTCACCCGCAGTCAGTGATTCACTCAATGGTGCGCTATCAGGACGGCAGTGTTCTGGCGCAGCTGGGGGAACCGGATATGCGTACGCCAATTGCCCACACCATGGCATGGCCGAATCGCGTGAACTCTGGCGTGAAGCCGCTCGATTTTTGCAAACTAAGTGCGTTGACATTTGCCGCACCGGATTATGATCGTTATCCATGCCTGAAACTGGCGATGGAGGCGTTCGAACAAGGCCAGGCAGCGACGACAGCATTGAATGCCGCAAACGAAATCACCGTTGCTGCTTTTCTTGCGCAACAAATCCGCTTTACGGATATCGCTGCGTTGAATTTATCCGTACTGGAAAAAATGGATATGCGCGAACCACAATGTGTGGACGATGTGTTATCTGTTGATGCGAACGCGCGTGAAGTCGCCAGAAAAGAGGTGATGCGTCTCGCAAGCTGA

Seq. 11

ATGGCAACCACTCATTTGGATGTTTGCGCCGTGGTTCCGGCGGCCGGATTTGGCCGTCGAATGCAAACGGAATGTCCTAAGCAATATCTCTCAATCGGTAATCAAACCATTCTTGAACACTCGGTGCATGCGCTGCTGGCGCATCCCCGGGTGAAACGTGTCGTCATTGCCATAAGTCCTGGCGATAGCCGTTTTGCACAACTTCCTCTGGCGAATCATCCGCAAATCACCGTTGTAGATGGCGGTGATGAGCGTGCCGATTCCGTGCTGGCAGGTCTGAAAGCCGCTGGCGACGCGCAGTGGGTATTGGTGCATGACGCCGCTCGTCCTTGTTTGCATCAGGATGACCTCGCGCGATTGTTGGCGTTGAGCGAAACCAGCCGCACGGGGGGGATCCTCGCCGCACCAGTGCGCGATACTATGAAACGTGCCGAACCGGGCAAAAATGCCATTGCTCATACCGTTGATCGCAACGGCTTATGGCACGCGCTGACGCCGCAATTTTTCCCTCGTGAGCTGTTACATGACTGTCTGACGCGCGCTCTAAATGAAGGCGCGACTATTACCGACGAAGCCTCGGCGCTGGAATATTGCGGATTCCATCCTCAGTTGGTCGAAGGCCGTGCGGATAACATTAAAGTCACGCGCCCGGAAGATTTGGCACTGGCCGAGTTTTACCTCACCCGAACCATCCATCAGGAGAATACATAA

Seq. 12

ATGCGGACACAGTGGCCCTCTCCGGCAAAACTTAATCTGTTTTTATACATTACCGGTCAGCGTGCGGATGGTTACCACACGCTGCAAACGCTGTTTCAGTTTCTTGATTACGGCGACACCATCAGCATTGAGCTTCGTGACGATGGGGATATTCGTCTGTTAACGCCCGTTGAAGGCGTGGAACATGAAGATAACCTGATCGTTCGCGCAGCGCGATTGTTGATGAAAACTGCGGCAGACAGCGGGCGTCTTCCGACGGGAAGCGGTGCGAATATCAGCATTGACAAGCGTTTGCCGATGGGCGGCGGTCTCGGCGGTGGTTCATCCAATGCCGCGACGGTCCTGGTGGCATTAAATCATCTCTGGCAATGCGGGCTAAGCATGGATGAGCTGGCGGAAATGGGGCTGACGCTGGGCGCAGATGTTCCTGTCTTTGTTCGGGGGCATGCCGCGTTTGCCGAAGGCGTTGGTGAAATACTAACGCCGGTGGATCCGCCAGAGAAGTGGTATCTGGTGGCGCACCCTGGTGTAAGTATTCCGACTCCGGTGATTTTTAAAGATCCTGAACTCCCGCGCAATACGCCAAAAAGGTCAATAGAAACGTTGCTAAAATGTGAATTCAGCAATGATTGCGAGGTTATCGCAAGAAAACGTTTTCGCGAGGTTGATGCGGTGCTTTCCTGGCTGTTAGAATACGCCCCGTCGCGCCTGACTGGGACAGGGGCCTGTGTCTTTGCTGAATTTGATACAGAGTCTGAAGCCCGCCAGGTGCTAGAGCAAGCCCCGGAATGGCTCAATGGCTTTGTGGCGAAAGGCGCTAATCTTTCCCCATTGCACAGAGCCATGCTTTAA

Seq. 13

ATGCGAATTGGACACGGTTTTGACGTACATGCCTTTGGCGGTGAAGGCCCAATTATCATTGGTGGCGTACGCATTCCTTACGAAAAAGGATTGCTGGCGCATTCTGATGGCGACGTGGCGCTCCATGCGTTGACCGATGCATTGCTTGGCGCGGCGGCGCTGGGGGATATCGGCAAGCTGTTCCCGGATACCGATCCGGCATTTAAAGGTGCCGATAGCCGCGAGCTGCTACGCGAAGCCTGGCGTCGTATTCAGGCGAAGGGTTATACCCTTGGCAACGTCGATGTCACTATCATCGCTCAGGCACCGAAGATGTTGCCGCACATTCCACAAATGCGCGTGTTTATTGCCGAAGATCTCGGCTGCCATATGGATGATGTTAACGTGAAAGCCACTACTACGGAAAAACTGGGATTTACCGGACGTGGGGAAGGGATTGCCTGTGAAGCGGTGGCGCTACTCATTAAGGCAACAAAATGA

Seq. 14

ATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACGTAGAAAATCAACACGTATTTACGTTGGGAATGTGCCGATTGGCGATGGTGCTCCCATCGCCGTACAGTCCATGACCAATACGCGTACGACAGACGTCGAAGCAACGGTCAATCAAATCAAGGCGCTGGAACGCGTTGGCGCTGATATCGTCCGTGTATCCGTACCGACGATGGACGCGGCAGAAGCGTTCAAACTCATCAAACAGCAGGTTAACGTGCCGCTGGTGGCTGACATCCACTTCGACTATCGCATTGCGCTGAAAGTAGCGGAATACGGCGTCGATTGTCTGCGTATTAACCCTGGCAATATCGGTAATGAAGAGCGTATTCGCATGGTGGTTGACTGTGCGCGCGATAAAAACATTCCGATCCGTATTGGCGTTAACGCCGGATCGCTGGAAAAAGATCTGCAAGAAAAGTATGGCGAACCGACGCCGCAGGCGTTGCTGGAATCTGCCATGCGTCATGTTGATCATCTCGATCGCCTGAACTTCGATCAGTTCAAAGTCAGCGTGAAAGCGTCTGACGTCTTCCTCGCTGTTGAGTCTTATCGTTTGCTGGCAAAACAGATCGATCAGCCGTTGCATCTGGGGATCACCGAAGCCGGTGGTGCGCGCAGCGGGGCAGTAAAATCCGCCATTGGTTTAGGTCTGCTGCTGTCTGAAGGCATCGGCGACACGCTGCGCGTATCGCTGGCGGCCGATCCGGTCGAAGAGATCAAAGTCGGTTTCGATATTTTGAAATCGCTGCGTATCCGTTCGCGAGGGATCAACTTCATCGCCTGCCCGACCTGTTCGCGTCAGGAATTTGATGTTATCGGTACGGTTAACGCGCTGGAGCAACGCCTGGAAGATATCATCACTCCGATGGACGTTTCGATTATCGGCTGCGTGGTGAATGGCCCAGGTGAGGCGCTGGTTTCTACACTCGGCGTCACCGGCGGCAACAAGAAAAGCGGCCTCTATGAAGATGGCGTGCGCAAAGACCGTCTGGACAACAACGATATGATCGACCAGCTGGAAGCACGCATTCGTGCGAAAGCCAGTCAGCTGGACGAAGCGCGTCGAATTGACGTTCAGCAGGTTGAAAAATAA

Seq. 15

ATGCAGATCCTGTTGGCCAACCCGCGTGGTTTTTGTGCCGGGGTAGACCGCGCTATCAGCATTGTTGAAAACGCGCTGGCCATTTACGGCGCACCGATATATGTCCGTCACGAAGTGGTACATAACCGCTATGTGGTCGATAGCTTGCGTGAGCGTGGGGCTATCTTTATTGAGCAGATTAGCGAAGTACCGGACGGCGCGATCCTGATTTTCTCCGCACACGGTGTTTCTCAGGCGGTACGTAACGAAGCAAAAAGTCGCGATTTGACGGTGTTTGATGCCACCTGTCCGCTGGTGACCAAAGTGCATATGGAAGTCGCCCGCGCCAGTCGCCGTGGCGAAGAATCTATTCTCATCGGTCACGCCGGGCACCCGGAAGTGGAAGGGACAATGGGCCAGTACAGTAACCCGGAAGGGGGAATGTATCTGGTCGAATCGCCGGACGATGTGTGGAAACTGACGGTCAAAAACGAAGAGAAGCTCTCCTTTATGACCCAGACCACGCTGTCGGTGGATGACACGTCTGATGTGATCGACGCGCTGCGTAAACGCTTCCCGAAAATTGTCGGTCCGCGCAAAGATGACATCTGCTACGCCACGACTAACCGTCAGGAAGCGGTACGCGCCCTGGCAGAACAGGCGGAAGTTGTGTTGGTGGTCGGTTCGAAAAACTCCTCCAACTCCAACCGTCTGGCGGAGCTGGCCCAGCGTATGGGCAAACGCGCGTTTTTGATTGACGATGCGAAAGACATCCAGGAAGAGTGGGTGAAAGAGGTTAAATGCGTCGGCGTGACTGCGGGCGCATCGGCTCCGGATATTCTGGTGCAGAATGTGGTGGCACGTTTGCAGCAGCTGGGCGGTGGTGAAGCCATTCCGCTGGAAGGCCGTGAAGAAAACATTGTTTTCGAAGTGCCGAAAGAGCTGCGTGTCGATATTCGTGAAGTCGATTAA

Seq. 16

ATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGAATGCACAGGGAGTTCCCACGGGTACGCTGGAAAAGTATGCCGCACACACGGCAGACACCCGCTTACATCTCGCGTTCTCCAGTTGGCTGTTTAATGCCAAAGGACAATTATTAGTTACCCGCCGCGCACTGAGCAAAAAAGCATGGCCTGGCGTGTGGACTAACTCGGTTTGTGGGCACCCACAACTGGGAGAAAGCAACGAAGACGCAGTGATCCGCCGTTGCCGTTATGAGCTTGGCGTGGAAATTACGCCTCCTGAATCTATCTATCCTGACTTTCGCTACCGCGCCACCGATCCGAGTGGCATTGTGGAAAATGAAGTGTGTCCGGTATTTGCCGCACGCACCACTAGTGCGTTACAGATCAATGATGATGAAGTGATGGATTATCAATGGTGTGATTTAGCAGATGTATTACACGGTATTGATGCCACGCCGTGGGCGTTCAGTCCGTGGATGGTGATGCAGGCGACAAATCGCGAAGCCAGAAAACGATTATCTGCATTTACCCAGCTTAAATAA

Seq. 17

ATGGACTTTCCGCAGCAACTCGAAGCCTGCGTTAAGCAGGCCAACCAGGCGCTGAGCCGTTTTATCGCCCCACTGCCCTTTCAGAACACTCCCGTGGTCGAAACCATGCAGTATGGCGCATTATTAGGTGGTAAGCGCCTGCGACCTTTCCTGGTTTATGCCACCGGTCATATGTTCGGCGTTAGCACAAACACGCTGGACGCACCCGCTGCCGCCGTTGAGTGTATCCACGCTTACTCATTAATTCATGATGATTTACCGGCAATGGATGATGACGATCTGCGTCGCGGTTTGCCAACCTGCCATGTGAAGTTTGGCGAAGCAAACGCGATTCTCGCTGGCGACGCTTTACAAACGCTGGCGTTCTCGATTTTAAGCGATGCCGATATGCCGGAAGTGTCGGACCGCGACAGAATTTCGATGATTTCTGAACTGGCGAGCGCCAGTGGTATTGCCGGAATGTGCGGTGGTCAGGCATTAGATTTAGACGCGGAAGGCAAACACGTACCTCTGGACGCGCTTGAGCGTATTCATCGTCATAAAACCGGCGCATTGATTCGCGCCGCCGTTCGCCTTGGTGCATTAAGCGCCGGAGATAAAGGACGTCGTGCTCTGCCGGTACTCGACAAGTATGCAGAGAGCATCGGCCTTGCCTTCCAGGTTCAGGATGACATCCTGGATGTGGTGGGAGATACTGCAACGTTGGGAAAACGCCAGGGTGCCGACCAGCAACTTGGTAAAAGTACCTACCCTGCACTTCTGGGTCTTGAGCAAGCCCGGAAGAAAGCCCGGGATCTGATCGACGATGCCCGTCAGTCGCTGAAACAACTGGCTGAACAGTCACTCGATACCTCGGCACTGGAAGCGCTAGCGGACTACATCATCCAGCGTAATAAATAA

Seq. 18

ATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTAAAGGAAGACTTAGGCCGCAAAAGCAACAACAATTACACAATACAAACTTGCAAATGACTGAACTAAAAAAACAAAAGACCGCTGAACAAAAAACCAGACCTCAAAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACCAATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGTCTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGATGTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACAAAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTCTGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTATTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTGAACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCGGTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGGTACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAGAGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCGAATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTGATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGCGATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGTTTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTATATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTAGCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTTTGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTGTTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCATCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTTATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGGTGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAAATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAAAGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGATGTTAAAAAATAA

Seq. 19 ATGTCACTTCCCTTAAAAACGATAGTACATTTGGTAAAGCCCTTTGCTTGCACTGCTAGGTTTAGTGCGAGATACCCAATCCACGTCATTGTTGTTGCTGTTTTATTGAGTGCCGCTGCTTATCTATCCGTGACACAATCTTACCTTAACGAATGGAAGCTGGACTCTAATCAGTATTCTACATACTTAAGCATAAAGCCGGATGAGTTGTTTGAAAAATGCACACACTACTATAGGTCTCCTGTGTCTGATACATGGAAGTTACTCAGCTCTAAAGAAGCCGCCGATATTTATACCCCTTTTCATTATTATTTGTCTACCATAAGTTTTCAAAGTAAGGACAATTCAACGACTTTGCCTTCCCTTGATGACGTTATTTACAGTGTTGACCATACCAGGTACTTATTAAGTGAAGAGCCAAAGATACCAACTGAACTAGTGTCTGAAAACGGAACGAAATGGAGATTGAGAAACAACAGCAATTTTATTTTGGACCTGCATAATATTTACCGAAATATGGTGAAGCAATTTTCTAACAAAACGAGCGAATTTGATCAGTTCGATTTGTTTATCATCCTAGCTGCTTACCTTACTCTTTTTTATACTCTCTGTTGCCTGTTTAATGACATGAGGAAAATCGGATCAAAGTTTTGGTTAAGCTTTTCTGCTCTTTCAAACTCTGCATGCGCATTATATTTATCGCTGTACACAACTCACAGTTTATTGAAGAAACCGGCTTCCTTATTAAGTTTGGTCATTGGACTACCATTTATCGTAGTAATTATTGGCTTTAAGCATAAAGTTCGACTTGCGGCATTCTCGCTACAAAAATTCCACAGAATTAGTATTGACAAGAAAATAACGGTAAGCAACATTATTTATGAGGCTATGTTTCAAGAAGGTGCCTACTTAATCCGCGACTACTTATTTTATATTAGCTCCTTCATTGGATGTGCTATTTATGCTAGACATCTTCCCGGATTGGTCAATTTCTGTATTTTGTCTACATTTATGCTAGTTTTCGACTTGCTTTTGTCTGCTACTTTTTATTCTGCCATTTTATCAATGAAGCTGGAAATTAACATCATTCACAGATCAACCGTCATCAGACAGACTTTGGAAGAGGACGGAGTTGTCCCAACTACAGCAGATATTATATATAAGGATGAAACTGCCTCAGAACCACATTTTTTGAGATCTAACGTGGCTATCATTCTGGGAAAAGCATCAGTTATTGGTCTTTTGCTTCTGATCAACCTTTATGTTTTCACAGATAAGTTAAATGCTACAATACTAAACACGGTATATTTTGACTCTACAATTTACTCGTTACCAAATTTTATCAATTATAAAGATATTGGCAATCTCAGCAATCAAGTGATCATTTCCGTGTTGCCAAAGCAATATTATACTCCGCTGAAAAAATACCATCAGATCGAAGATTCTGTTCTACTTATCATTGATTCCGTTAGCAATGCTATTCGGGACCAATTTATCAGCAAGTTACTTTTTTTTGCATTTGCAGTTAGTATTTCCATCAATGTCTACTTACTGAATGCTGCAAAAATTCACACAGGATACATGAACTTCCAACCACAATCAAATAAGATCGATGATCTTGTTGTTCAGCAAAAATCGGCAACGATTGAGTTTTCAGAAACTCGAAGTATGCCTGCTTCTTCTGGCCTAGAAACTCCAGTGACCGCGAAAGATATAATTATCTCTGAAGAAATCCAGAATAACGAATGCGTCTATGCTTTGAGTTCCCAGGACGAGCCTATCCGTCCTTTATCGAATTTAGTGGAACTTATGGAGAAAGAACAATTAAAGAACATGAATAATACTGAGGTTTCGAATCTTGTCGTCAACGGTAAACTGCCATTATATTCCTTAGAGAAAAAATTAGAGGACACAACTCGTGCGGTTTTAGTTAGGAGAAAGGCACTTTCAACTTTGGCTGAATCGCCAATTTTAGTTTCCGAAAAATTGCCCTTCAGAAATTATGATTATGATCGCGTTTTTGGAGCTTGCTGTGAAAATGTCATCGGCTATATGCCAATACCAGTTGGTGTAATTGGTCCATTAATTATTGATGGAACATCTTATCACATACCAATGGCAACCACGGAAGGTTGTTTAGTGGCTTCAGCTATGCGTGGTTGCAAAGCCATCAATGCTGGTGGTGGTGCAACAACTGTTTTAACCAAAGATGGTATGACTAGAGGCCCAGTCGTTCGTTTCCCTACTTTAATAAGATCTGGTGCCTGCAAGATATGGTTAGACTCGGAAGAGGGACAAAATTCAATTAAAAAAGCTTTTAATTCTACATCAAGGTTTGCACGTTTGCAACATATTCAAACCTGTCTAGCAGGCGATTTGCTTTTTATGAGATTTCGGACAACTACCGGTGACGCAATGGGTATGAACATGATATCGAAAGGTGTCGAATACTCTTTGAAACAAATGGTAGAAGAATATGGTTGGGAAGATATGGAAGTTGTCTCCGTATCTGGTAACTATTGTACTGATAAGAAACCTGCCGCAATCAATTGGATTGAAGGTCGTGGTAAAAGTGTCGTAGCTGAAGCTACTATTCCTGGTGATGTCGTAAAAAGTGTTTTAAAGAGCGATGTTTCCGCTTTAGTTGAATTAAATATATCCAAGAACTTGGTTGGATCCGCAATGGCTGGATCTGTTGGTGGTTTCAACGCGCACGCAGCTAATTTGGTCACTGCACTTTTCTTGGCATTAGGCCAAGATCCTGCGCAGAACGTCGAAAGTTCCAACTGTATAACTTTGATGAAGGAAGTTGATGGTGATTTAAGGATCTCTGTTTCCATGCCATCTATTGAAGTTGGTACGATTGGCGGGGGTACTGTTCTGGAGCCTCAGGGCGCCATGCTTGATCTTCTCGGCGTTCGTGGTCCTCACCCCACTGAACCTGGAGCAAATGCTAGGCAATTAGCTAGAATAATCGCGTGTGCTGTCTTGGCTGGTGAACTGTCTCTGTGCTCCGCACTTGCTGCCGGTCACCTGGTACAAAGCCATATGACTCACAACCGTAAAACAAACAAAGCCAATGAACTGCCACAACCAAGTAACAAAGGGCCCCCCTGTAAAACCTCAGCATTATTATAA

Seq. 20

ATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGCACCGGGAAAGGTTATTATTTTTGGTGAACACTCTGCTGTGTACAACAAGCCTGCCGTCGCTGCTAGTGTGTCTGCGTTGAGAACCTACCTGCTAATAAGCGAGTCATCTGCACCAGATACTATTGAATTGGACTTCCCGGACATTAGCTTTAATCATAAGTGGTCCATCAATGATTTCAATGCCATCACCGAGGATCAAGTAAACTCCCAAAAATTGGCCAAGGCTCAACAAGCCACCGATGGCTTGTCTCAGGAACTCGTTAGTCTTTTGGATCCGTTGTTAGCTCAACTATCCGAATCCTTCCACTACCATGCAGCGTTTTGTTTCCTGTATATGTTTGTTTGCCTATGCCCCCATGCCAAGAATATTAAGTTTTCTTTAAAGTCTACTTTACCCATCGGTGCTGGGTTGGGCTCAAGCGCCTCTATTTCTGTATCACTGGCCTTAGCTATGGCCTACTTGGGGGGGTTAATAGGATCTAATGACTTGGAAAAGCTGTCAGAAAACGATAAGCATATAGTGAATCAATGGGCCTTCATAGGTGAAAAGTGTATTCACGGTACCCCTTCAGGAATAGATAACGCTGTGGCCACTTATGGTAATGCCCTGCTATTTGAAAAAGACTCACATAATGGAACAATAAACACAAACAATTTTAAGTTCTTAGATGATTTCCCAGCCATTCCAATGATCCTAACCTATACTAGAATTCCAAGGTCTACAAAAGATCTTGTTGCTCGCGTTCGTGTGTTGGTCACCGAGAAATTTCCTGAAGTTATGAAGCCAATTCTAGATGCCATGGGTGAATGTGCCCTACAAGGCTTAGAGATCATGACTAAGTTAAGTAAATGTAAAGGCACCGATGACGAGGCTGTAGAAACTAATAATGAACTGTATGAACAACTATTGGAATTGATAAGAATAAATCATGGACTGCTTGTCTCAATCGGTGTTTCTCATCCTGGATTAGAACTTATTAAAAATCTGAGCGATGATTTGAGAATTGGCTCCACAAAACTTACCGGTGCTGGTGGCGGCGGTTGCTCTTTGACTTTGTTACGAAGAGACATTACTCAAGAGCAAATTGACAGCTTCAAAAAGAAATTGCAAGATGATTTTAGTTACGAGACATTTGAAACAGACTTGGGTGGGACTGGCTGCTGTTTGTTAAGCGCAAAAAATTTGAATAAAGATCTTAAAATCAAATCCCTAGTATTCCAATTATTTGAAAATAAAACTACCACAAAGCAACAAATTGACGATCTATTATTGCCAGGAAACACGAATTTACCATGGACTTCATAA

Seq. 21

ATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCCCCAGGGAAAGCGTTACTAGCTGGTGGATATTTAGTTTTAGATACAAAATATGAAGCATTTGTAGTCGGATTATCGGCAAGAATGCATGCTGTAGCCCATCCTTACGGTTCATTGCAAGGGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTGTGAAAAGTAAACAATTTAAAGATGGGGAGTGGCTGTACCATATAAGTCCTAAAAGTGGCTTCATTCCTGTTTCGATAGGCGGATCTAAGAACCCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTATTTAGCTACTTTAAACCTAACATGGACGACTACTGCAATAGAAACTTGTTCGTTATTGATATTTTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGATAGCGTTACCGAACATCGTGGCAACAGAAGATTGAGTTTTCATTCGCACAGAATTGAAGAAGTTCCCAAAACAGGGCTGGGCTCCTCGGCAGGTTTAGTCACAGTTTTAACTACAGCTTTGGCCTCCTTTTTTGTATCGGACCTGGAAAATAATGTAGACAAATATAGAGAAGTTATTCATAATTTAGCACAAGTTGCTCATTGTCAAGCTCAGGGTAAAATTGGAAGCGGGTTTGATGTAGCGGCGGCAGCATATGGATCTATCAGATATAGAAGATTCCCACCCGCATTAATCTCTAATTTGCCAGATATTGGAAGTGCTACTTACGGCAGTAAACTGGCGCATTTGGTTGATGAAGAAGACTGGAATATTACGATTAAAAGTAACCATTTACCTTCGGGATTAACTTTATGGATGGGCGATATTAAGAATGGTTCAGAAACAGTAAAACTGGTCCAGAAGGTAAAAAATTGGTATGATTCGCATATGCCAGAAAGCTTGAAAATATATACAGAACTCGATCATGCAAATTCTAGATTTATGGATGGACTATCTAAACTAGATCGCTTACACGAGACTCATGACGATTACAGCGATCAGATATTTGAGTCTCTTGAGAGGAATGACTGTACCTGTCAAAAGTATCCTGAAATCACAGAAGTTAGAGATGCAGTTGCCACAATTAGACGTTCCTTTAGAAAAATAACTAAAGAATCTGGTGCCGATATCGAACCTCCCGTACAAACTAGCTTATTGGATGATTGCCAGACCTTAAAAGGAGTTCTTACTTGCTTAATACCTGGTGCTGGTGGTTATGACGCCATTGCAGTGATTACTAAGCAAGATGTTGATCTTAGGGCTCAAACCGCTAATGACAAAAGATTTTCTAAGGTTCAATGGCTGGATGTAACTCAGGCTGACTGGGGTGTTAGGAAAGAAAAAGATCCGGAAACTTATCTTGATAAATAA

Seq. 22

ATGACCGTTTACACAGCATCCGTTACCGCACCCGTCAACATCGCAACCCTTAAGTATTGGGGGAAAAGGGACACGAAGTTGAATCTGCCCACCAATTCGTCCATATCAGTGACTTTATCGCAAGATGACCTCAGAACGTTGACCTCTGCGGCTACTGCACCTGAGTTTGAACGCGACACTTTGTGGTTAAATGGAGAACCACACAGCATCGACAATGAAAGAACTCAAAATTGTCTGCGCGACCTACGCCAATTAAGAAAGGAAATGGAATCGAAGGACGCCTCATTGCCCACATTATCTCAATGGAAACTCCACATTGTCTCCGAAAATAACTTTCCTACAGCAGCTGGTTTAGCTTCCTCCGCTGCTGGCTTTGCTGCATTGGTCTCTGCAATTGCTAAGTTATACCAATTACCACAGTCAACTTCAGAAATATCTAGAATAGCAAGAAAGGGGTCTGGTTCAGCTTGTAGATCGTTGTTTGGCGGATACGTGGCCTGGGAAATGGGAAAAGCTGAAGATGGTCATGATTCCATGGCAGTACAAATCGCAGACAGCTCTGACTGGCCTCAGATGAAAGCTTGTGTCCTAGTTGTCAGCGATATTAAAAAGGATGTGAGTTCCACTCAGGGTATGCAATTGACCGTGGCAACCTCCGAACTATTTAAAGAAAGAATTGAACATGTCGTACCAAAGAGATTTGAAGTCATGCGTAAAGCCATTGTTGAAAAAGATTTCGCCACCTTTGCAAAGGAAACAATGATGGATTCCAACTCTTTCCATGCCACATGTTTGGACTCTTTCCCTCCAATATTCTACATGAATGACACTTCCAAGCGTATCATCAGTTGGTGCCACACCATTAATCAGTTTTACGGAGAAACAATCGTTGCATACACGTTTGATGCAGGTCCAAATGCTGTGTTGTACTACTTAGCTGAAAATGAGTCGAAACTCTTTGCATTTATCTATAAATTGTTTGGCTCTGTTCCTGGATGGGACAAGAAATTTACTACTGAGCAGCTTGAGGCTTTCA

一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。