专利摘要

本发明阐述了一种酶法非水相催化合成(R)‑3‑TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物，属于生物工程技术领域。本发明涉及瑞舒伐他汀钙(Rosuvastatin)的制备，尤其是其中一关键中间体的制备方法。本发明公开一种采用Novozyme435酶法催化合成(R)‑3‑TBDMSO戊二酸单酯(R‑J6)及其衍生物的方法，采用本方法对酶转化条件进行了优化，反应24h后R‑J6产物含量可达67.1g/L，优化后的R‑J6的产量是优化前(优化前为4.5g/L)的14.倍；正交实验发现酶催化的影响因素主次顺序为：底物浓度＞醇酐摩尔比＞酶浓度；最优的酶转化体系为底物浓度250g/L，酶浓度60g/L，醇酐摩尔比2∶1，溶剂为异辛烷，催化温度为35℃，酶转化24h后，转化液中R‑J6含量可达68.9g/L，生产强度2.87(g/L·h)。

权利要求

1.一种酶法非水相催化合成 (R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物的制备方法，其制备过程用以下反应式表示 ：

上式中，R为甲基，乙基，正丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，正已基；底物为3-TBDMSO 戊二酸酐或 3-TBDMSO 戊二酸 ；其主要原理是在非水相有机溶剂中，利用脂肪酶Novozyme435催化底物，使之醇解，实现二羧酸的单酯化，通过无机碱 NaHCO3调节pH值，有机溶剂萃取，可以得到手性化合物(R)-3-TBDMSO戊二酸单酯；

所述的有机溶剂选自异辛烷、正己烷、正辛烷；所述脂肪酶为下列之一：LipozymeTLIM、Novozym435、Trypsin；所述的底物选自3-TBDMSO戊二酸酐或3-TBDMSO戊二酸。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述底物为3-TBDMSO戊二酸酐。

3.根据权利要求1所示的一种酶法非水相催化合成 (R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物的制备方法，其特征在于 ：所述的醇选自甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于所述醇为甲醇。

5.根据权利要求1所示的一种酶法非水相催化合成 (R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述的Novozym435预先用不同pH的缓冲溶液处理后真空干燥，使酶所“记忆”的pH在7.2-9.5之间，而后用于酶的手性催化。

6.根据权利要求1所示的一种酶法非水相催化合成 (R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述3-TBDMSO戊二酸酐底物浓度为160-250g/L；辅底物甲醇与底物的摩尔浓度比值为1∶1-5∶1；酶的添加浓度为20-90g/L；酶催化体系温度维持在35-50℃；酶催化反应时间6-45h；(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯的产量可达68.87g/L，生产强度为2.87 g/L·h。

7.根据权利要求1所示的一种酶法非水相催化合成 (R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物的制备方法，其特征在于：所述的(R)-3-TBDMSO及其衍生物检测方法采用高效液相检测法，其色谱柱为Daicel ChiralPak AD-H 5μm 4.0×250mm，流动相为正己烷n-Hexane：异丙醇Iso-propanol＝96∶4，0.02％三氟乙酸v/v，用0.45μm滤膜过滤，柱温为5-40℃，检测波长为 210-350nm，进样量为5-30μl，流速为0.5-1.5ml/min。

说明书

技术领域

一种酶法非水相催化合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物，属于生物工程领域。本发明涉及瑞舒伐他汀钙(Rosuvastatin)的制备，尤其是其中一关键中间体的制备方法。

背景技术

(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯中文全名为(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸甲单酯，它是合成瑞舒伐他汀钙(Rosuvastatin)的关键中间体，其化学结构式如下：

瑞舒伐他汀钙(Rosuvastatin Calcium)是一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶抑制剂，可降低升高的低密度胆固醇、总胆固醇、甘油三酯和脱辅基蛋白B的浓度，同时升高高密度胆固醇的浓度，可用于原发性高胆固醇血症、混合型脂肪代谢障碍症及纯合家族性高胆固醇血症的综合治疗；瑞舒伐他汀钙抑制HMG-CoA还原酶的作用比现有上市他汀类药物更强，而且具有肝细胞选择性，具有高效、低毒、副作用小等优点，他汀类药物据报道还具有抗艾滋病毒(HIV)的作用，并且还有其他潜在的应用价值备受人们的青睐，市场前景相当好，市场需求趋旺。但由于它的制备有相当难度，其异构体含量的控制极为严格，需要有更能确保其光学结构的工艺来制备，采用(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯中间体化学法合成瑞舒伐他汀钙工艺流程如下：

目前制备手性(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯类化合物，主要是通过化学法合成的，常见的有手性试剂法和催化剂法。文献(J.Org.Chem.Vol.59，No.25，7849-7854，1994)公开了以酸酐化合物为原料制备(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯：

但是，该方法的第一步反应产物收率低，需要购买价格高昂的手性试剂，后续处理复杂，对环境污染严重，同样存在制备成本较高的问题，添加催化剂法合成R-J6反应条件苛刻，化学法一般在极端的条件下(如低温)进行，需要价格昂贵的催化剂，且催化剂中往往含有重金属，影响产品的质量，生产过程能耗大，容易产生大量废水，造成环境污染，不适于工业化大规模生产。而人们研究发现酶催化反应具有反应条件温和、副反应少、选择性高、环境污染小等优点。生物酶法主要是采用不对称还原或者不对称水解得到的。目前，制备方法中的主要不足之处为：3-羰基-戊二酸或3-取代-戊二酸二酯(底物)在水溶液中的溶解度很小、投料的浓度非常低和得到的产物(R)-3-羟基戊二酸单酯的产量极低。因此寻找一条新的制备方法来解决目前合成方法中存在的不足之处至关重要。

发明内容

本发明采用的技术方案是：本发明的目的是提供一种反应步骤短、成本较低、高产量的酶法非水相催化合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)及其衍生物的制备方法。该方法所述脂肪酶为下列之一：LipozymeTLIM、Novozym435、Trypsin，均为市购脂肪酶，优选Novozyme435为催化剂，底物为3-TBDMSO戊二酸酐或3-TBDMSO戊二酸，辅底物为甲醇或乙醇或丙醇或丁醇或苯甲醇，工艺简单、绿色环保无污染。为解决上述技术问题，实现大规模生产R-J6，本发明的主要反应流程如下：

上式中，R为甲基，乙基，丙基，丁基，或苄基，以及其它C1-C8任意取代烷基；底物为3-TBDMSO戊二酸酐或3-TBDMSO戊二酸；

本发明的技术方案：

1、(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及底物含量高效液相色谱法的建立

样品经5000rpm离心2min除去酶，取有机相于离心管中，置于电热恒温鼓风干燥箱中烘干除去溶剂，将样品溶于适量的流动相中(稀释适当的倍数)，用0.22μm有机膜过滤，滤液用于液相进样检测。以(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯作为标准品，配制0.5、1、2、2.7、3.3、3.8、6、8、10、12、17、20g/L的标准溶液。以3-TBDMSO戊二酸酐作为标准品，配制2、4、6、8、10、15、16g/L的标准溶液。将上清液与标准溶液经0.22μm微孔有机滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯和底物(3-TBDMSO戊二酸酐)的含量。

色谱条件：

色谱柱：DAICEL ChiralPak AD-H 5μm(4.0×250mm)；

流动相：正己烷(n-Hexane)∶异丙醇(Iso-propanol)＝96∶4(0.02％三氟乙酸(v/v))；，用0.45μm滤膜过滤；

柱温：25℃；检测波长：210nm；

进样量：10μl；流速：1.0ml/min；

(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)标样出峰时间为7.778min(图1)；R-J6在0.5～20.0g/L浓度范围内线性关系最好，如图2，R-J6回归方程：Y＝126.9X-18.414(Y表示R-J6的峰面积；X表示R-J6标样浓度)，相关系数R2＝0.99945。

3-TBDMSO戊二酸酐(底物)出峰时间为11.341min(图3)，3-TBDMSO戊二酸酐在1.0～20.0g/L浓度范围内线性关系最好，如图4，底物回归方程：Y＝121.48X+28.045(Y表示峰面积；X表示底物标样的浓度)，相关系数R2＝0.99907。实验证明，采用相同的检测条件能同时测定目标产物R-J6的产物含量和底物浓度。

2、一种产(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯的计算机辅助筛选辅底物(醇)

化学法制备瑞舒伐他汀钙最后一步工艺流程如下：

其支链中的酯键最终均会被水解，说明醇(辅底物)的种类对最终产品质量无影响。而不同种类醇的空间结构不同、对酶的构象影响不同，即不同种类醇影响酶的对映体选择性。选择不同的醇作为配体，观察R型产物与S型产物与酶蛋白分子对接自由能的比值的变化。除苯甲醇和苯乙醇外，以其他醇为辅底物时，酯化反应均可以发生，均能检测到单酯化产物存在。通过比较，发现若选择甲醇为辅底物，其ER/ES的比值最高，为1.072，说明它更利于合成R构型的产物，故优选甲醇作为辅底物。

3、一种酶法生产(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)的脂肪酶的筛选。

所述酶为不同来源的脂肪酶(商品化的固定化脂肪Novozyme435(N435)和Lipozyme TLIM均具有较高催化活性，市售价较低的胰酶)，筛选利于合成R-J6的最佳酶，并将其应用于R-J6的生产。转化后用高效液相色谱法测定产物含量。研究发现，转化24h后Novozyme435催化合成29.3g/L的R-J6，此时其上产强度达到1.22(g/L·h)，故优选Novozyme435。

4、一种酶法生产(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)的反应条件优化。

优化环境条件对酯化反应的影响，，当Novozyme435固定化酶初始pH在7.2-8.6之间，R-J6的产量变化不大，保持在0.7-1.4g/L左右，当初始pH为9.5时，R-J6的产量达到4.2g/L；当所述的温度为35℃时，R-J6的产量达到17.03g/L；所述的有机溶剂选自甲基叔丁醚、异辛烷、正己烷、正辛烷，当溶剂为异辛烷时，R-J6的产量达到21.5g/L左右；酶转化条件优化以后，用HPLC测得转化液中R-J6含量为67.1g/L。

3-TBDMSO戊二酸酐浓度(底物浓度)、甲醇(辅底物)与底物的摩尔比(醇酐摩尔比)、固定化酶Novozyme435浓度(酶浓度)三因素三水平正交试验结果发现如下：酶催化的影响因素主次顺序为：底物浓度＞醇酐摩尔比＞酶浓度；最优的酶转化体系为底物浓度250g/L，酶浓度60g/L，醇酐摩尔比2∶1；溶剂为异辛烷；催化温度为35℃，酶转化条以后，转化液中R-J6含量可达68.9g/L，生产强度2.87(g/L·h)。

附图说明

图1为(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)(单一构型)标样液相色谱图。

图2为(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(单一构型)标准曲线。

图3为3-TBDMSO戊二酸酐标样液相色谱图。

图4为3-TBDMSO戊二酸酐线性回归曲线。

图5初始pH对(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯酶法合成的影响关系图。

图6温度对(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯合成的影响关系图。

图7不同溶剂对(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯酶法合成的影响关系图。

图8甲醇与酸酐摩尔比值对(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯合成的影响关系图。

图9Novozyme43酶浓度对酶法合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯的影响关系图。

图10底物浓度对(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯酶法合成的影响关系图。

具体实施方式

以下是非水相酶法催化生产(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯的实施例。

1.最优辅底物醇结构筛选

用Chem-Office软件构建采用不同种类的醇合成的产物J的三维结构(构建X不同的产物J的三维结构)，能量优化用Charmm力场。不同的产物J作为配体分别与PDB网站上获得的CALB(1TCA)晶体结构进行分子对接，最后对对接能量进行比较(见表1)。比较发现，当甲醇为辅底物时，其ER/ES的比值最高，它更利于合成R构型的产物，故优选甲醇作为辅底物。

表1不同醇与CALB酶的分子对接能量比较

a.ER/ES为R异构体的对接能量与R异构体的对接能量的比值(Kcal/mol).

b.“+”表示酶催化反应可以发生，且转化液中能检测到单酯产物存在，“-”表示反应转化液中未能检测到单酯产物存在。

2.不同脂肪酶酶法合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)的催化效果。

3-TBDMSO戊二酸酐(底物)浓度为120g/L，最终酶浓度为60g/L，辅底物(甲醇)与底物的摩尔比为3∶1，溶剂为甲基叔丁基醚(MTBE)，反应温度37℃，摇床转速为200rpm。采用不同来源的固定化脂肪酶，考察不同脂肪酶对R-J6产量的影响，转化后用高效液相色谱法测定产物含量，结果见表2。研究发现，转化24h后Novozyme435催化合成29.3g/L的R-J6，此时其生产强度为1.22(g/L·h)，故催化剂优选Novozyme435。

表2.比较用于合成R-J6的不同脂肪酶的转化效果

3.初始pH优化：

Novozyme435为催化剂，3-TBDMSO戊二酸酐(底物)30g/L，最终加酶量为0.1g，反应体系10mL，甲醇与底物的摩尔比为3∶1；称取等量的Novozyme 435在pH分别为6.1、6.8、7.2、8.0、8.6、9.5水溶液中处理过夜，冷冻干燥除去所有的水，在MTBE溶剂中进行转化，转化温度为35℃，转速为200r/min，检测R-J6产量。当初始pH在7.2-8.6之间，R-J6的产量变化不大，维持在0.7-1.4g/L左右；当初始pH为9.5时，R-J6的产量达到4.2g/L，如图5所示。

4.温度优化：

Novozyme435为催化剂，其最终浓度为80g/L，以异辛烷为溶剂，向20g/L的3-TBDMSO戊二酸酐(底物)中，反应体系总体积为10mL，底物与甲醇摩尔比为3∶1；分别在温度为22℃、30℃、35℃、40℃、45℃，200r/min条件下转化，检测R-J6产量。结果如图6所示，当温度为35℃时，R-J6的产量达到18.03g/L。优选催化温度为35℃。

5.溶剂优化：

Novozyme435为催化剂，3-TBDMSO戊二酸酐(底物)浓度40g/L，最终酶浓度为20g/L，辅底物(甲醇)与底物的摩尔比3∶1，溶剂分别为甲基叔丁基醚、正己烷、正辛烷、异辛烷、异辛烷(5％甲苯(v/v))，反应温度35℃，摇床转速为200rpm，转化24h。用高效液相色谱法测定(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯(R-J6)含量。结果如图7所示，当选取异辛烷为溶剂时，R-J6含量最高达到21.5g/L，R-J6产率达到35％，优选异辛烷为反应溶剂。

6.甲醇与酸酐摩尔比值(醇酐比)优化：

Novozyme435为催化剂，以异辛烷为溶剂，3-TBDMSO戊二酸酐(底物)40g/L，最终酶浓度为20g/L，反应体系10mL，甲醇与底物摩尔比分别为1、2、3、4、5；反应温度35℃，摇床转速为200rpm，转化24h。检测R-J6产量。结果如图8所示，当醇酐摩尔比达到2∶1时，目标产物R-J6的产量和产率均达到最大，分别为9.8g/L和20％，随后提高醇酐摩尔比，对R-J6产量影响不大，酶法合成R-J6最优醇酐摩尔比为2∶1。

7.酶浓度优化：

Novozyme435为催化剂，以异辛烷为溶剂，辅底物(甲醇)与底物的摩尔比2∶1，3-TBDMSO戊二酸酐(底物)浓度60g/L，最终加酶量分别为10g/L、20g/L、50g/L、60g/L、90g/L，反应体系10mL，反应温度35℃，摇床转速为200rpm，转化24h。检测R-J6产量。结果如图9所示，当酶浓度达到60g/L时，目标产物R-J6的产量和产率均达到最大，分别为13.2g/L和22％；故优选酶浓度为60g/L。

8.底物浓度优化：

Novozyme435为催化剂，异辛烷为溶剂，辅底物(甲醇)与底物的摩尔比为2∶1，以60g/L脂肪酶N435为反应催化剂，3-TBDMSO戊二酸酐(底物)浓度分别为40g/L、50g/L、80g/L、100g/L、160g/L、200g/L，反应体系10mL，反应温度为35℃，摇床转速为200rpm，转化24h。检测R-J6产量。结果如图10所示，当底物浓度达到200g/L时，R-J6的产率为33.53％，R-J6的产量达到最高达67.1g/L。故固定化酶合成R-J6较优底物浓度为200g/L。

9.正交试验优化：

正交实验表采用Design-Expert 8.0软件进行设计。考察3-TBDMSO戊二酸酐浓度(底物浓度)、甲醇(辅底物)与底物的摩尔比(醇酐摩尔比)、固定化酶Novozyme435浓度(酶浓度)对酯化反应的综合影响情况。反应溶剂为异辛烷，反应温度为35℃，摇床转速为200rpm，转化24h。检测R-J6产量。酶催化的影响因素主次顺序为：底物浓度＞醇酐摩尔比＞酶浓度；最优的酶转化体系为底物浓度250g/L，酶浓度60g/L，醇酐摩尔比2∶1；溶剂为异辛烷；催化温度为35℃，

表3.正交试验表

一种酶法非水相催化合成(R)-3-TBDMSO戊二酸甲单酯及其衍生物专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。