专利摘要

本发明涉及一种喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法及应用，属于医药技术领域。本发明所述方法以喜旱莲子草为原料，依次采用超声溶剂提取法、溶剂萃取法等工艺，并结合减压浓缩干燥、真空干燥、常压浓缩干燥等干燥方法，制备成喜旱莲子草石油醚提取物，将制成的喜旱莲子草石油醚提取物作为抗癌活性成分，使之在癌症治疗中进行应用。本发明这种对环境危害较大的喜旱莲子草提供了一种新的途径，同时也为开发中草药的抗癌活性研究提供了一定的实验基础以及一种新的思路，选用中草药的不同萃取物进行抗癌活性筛选。

权利要求

1.一种喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）按喜旱莲子草和乙醇体积比为1:2~1:5的比例将喜旱莲子草浸入乙醇溶液中，通过超声提取法，提取至乙醇溶液颜色较淡或无色为止；

（2）收集提取液，采用减压蒸馏浓缩乙醇超声提取物至无醇味；

（3）收集得到的乙醇超声提取物，按超声提取物与蒸馏水的体积比1:1~1:2，在超声提取物中加入蒸馏水混匀得到混合溶液，按混合溶液与石油醚的体积比为1:1~1:2的比例在混合溶液中加入石油醚进行多次萃取，直到石油醚萃取相无色；

（4）收集石油醚萃取物，减压蒸馏浓缩萃取物后，萃取物用无水乙醇溶解，然后进行初步常压干燥，初步干燥后的石油醚萃取物进行真空干燥后得到干燥石油醚萃取物。

2.根据权利要求1所述的喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，其特征在于：所述喜旱莲子草为新鲜采集或者经过干燥的根茎、枝叶、果实中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的减压蒸馏选用旋转蒸发仪，条件为43℃~48℃，真空度为0.04~0.06Mpa。

4.根据权利要求1所述的喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的减压蒸馏选用旋转蒸发仪，条件为43℃~48℃，真空度为0.04~0.06Mpa。

5.根据权利要求1所述的喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的常压干燥过程中，干燥温度为40℃~50℃，干燥时间为8~12h，真空干燥过程中，干燥温度为40℃~50℃，干燥时间为8~12h。

6.权利要求1所述喜旱莲子草石油醚提取物在制备抗癌药物中的运用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法及运用，属于医药技术领域。

背景技术

喜旱莲子草，别名空心莲子草、革命草、水花生等，是苋科的一种植物。这种植物原产巴西，1930年传入我国，被列为中国首批外来物种。该植物生命力极强，适应水生和陆生环境，生长繁殖迅速，人为的引种扩散又使其滋生蔓延，已经成为了我国大部分地区的恶性杂草，因此该植物也被认为是一种危害极大的入侵物种。已有研究发现，该植物含有蒽醌类、甾醇类、黄酮类、三萜类等等化合物。现代药理学研究表明该植物清热解毒、凉血，可用于治疗病毒感染而致的疾病，以及流行性乙型脑炎早期、流行性出血热初期、麻疹等疾病。

但是，迄今为止，对喜旱莲子草的抗癌作用的研究还比较少，其中2007年中国台湾的方金帛等对喜旱莲子草的乙酸乙酯提取物进行了抗癌作用的研究，发现其对人宫颈癌细胞Hela细胞以及小鼠成纤维细胞L929进行了抗癌作用研究，发现喜旱莲子草的乙酸乙酯提取物对这两种细胞具有一定的生物活性。

癌症是当今社会发病率高，死亡率高的一种顽疾，目前尚未有能够治愈率较高的药物报道。本发明人在寻找中草药抗癌活性成分的过程中，发现喜旱莲子草的石油醚提取物具有良好的抗肿瘤活性。这为后期这种植物提取物的抗癌或辅助治疗作用研究奠定了一定的基础，也对开发利用这种有危害的入侵物种起到了一定的推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，为喜旱莲子草在抗癌药物研究中的应用奠定了一定的基础，同时为综合治理这种有危害的入侵物种提供了一定的途径。

本发明所述喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法以喜旱莲子草为原料，依次采用超声溶剂提取法、溶剂萃取法等工艺，并结合减压浓缩干燥、真空干燥、常压浓缩干燥等干燥方法，制备成喜旱莲子草石油醚提取物，将制成的喜旱莲子草石油醚提取物作为抗癌活性成分，使之在癌症治疗中进行应用。

本发明所述喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法具体包括以下步骤：

（1）按喜旱莲子草和乙醇体积比为1:2~1:5的比例将喜旱莲子草浸入乙醇溶液中，通过超声提取法，提取至乙醇溶液颜色较淡或无色为止；

（2）收集提取液，采用减压蒸馏浓缩乙醇超声提取物至无醇味；

（3）收集得到的乙醇超声提取物，按超声提取物与蒸馏水的体积比1:1~1:2，在超声提取物中加入蒸馏水混匀得到混合溶液，按混合溶液与石油醚的体积比为1:1~1:2的比例在混合溶液中加入石油醚进行多次萃取，直到石油醚萃取相无色；

（4）收集石油醚萃取物，减压蒸馏浓缩萃取物后，萃取物用无水乙醇溶解，然后进行初步常压干燥，初步干燥后的石油醚萃取物进行真空干燥后得到干燥石油醚萃取物。

本发明所述喜旱莲子草为新鲜采集或者经过干燥的根茎、枝叶、果实中的一种或多种。

本发明步骤（2）中所述的减压蒸馏选用旋转蒸发仪，条件为43℃~48℃，真空度为0.04~0.06Mpa。

本发明步骤（4）中所述的减压蒸馏选用旋转蒸发仪，条件为43℃~48℃，真空度为0.04~0.06Mpa。

本发明步骤（4）中所述的常压干燥过程中，干燥温度为40℃~50℃，干燥时间为8~12h，真空干燥过程中，干燥温度为40℃~50℃，干燥时间为8~12h，真空度为0.06~0.08Mpa。

本发明所述乙醇的质量百分比浓度为90%~98%。

本发明所述喜旱莲子草石油醚提取物在制备抗癌药物中的运用。

喜旱莲子草的石油醚提取物制备工艺简单实用，同时具有良好的抗癌活性。为综合利用这种对环境危害较大的入侵物种提供了一种新的途径，同时也为开发中草药的抗癌活性研究提供了一定的实验基础以及一种新的思路即选用中草药的不同萃取物进行抗癌活性筛选。 

附图说明

图1 实施例1喜旱莲子草石油醚提取物抑制MCF-7细胞生长时间效应曲线；

图2实施例1喜旱莲子草石油醚提取物抑制A549细胞生长时间效应曲线；

图3实施例1喜旱莲子草石油醚提取物抑制MCF-7细胞IC50曲线；

图4实施例1喜旱莲子草石油醚提取物抑制A549细胞IC50曲线。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

本实施例所述述喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）按喜旱莲子草和乙醇体积比为1:3的比例将喜旱莲子草浸入乙醇溶液中，通过超声提取法，提取至乙醇溶液颜色较淡或无色为止；

（2）收集提取液，采用旋转蒸发仪在温度为47℃，真空度为0.05Mpa的条件下对提取液进行减压蒸馏，浓缩乙醇超声提取物至无醇味；

（3）收集得到的乙醇超声提取物，按超声提取物与蒸馏水的体积比1:1.5，在超声提取物中加入蒸馏水混匀得到混合溶液，按混合溶液与石油醚的体积比为1:1.5的比例在混合溶液中加入石油醚进行多次萃取，直到石油醚萃取相无色；

（4）收集石油醚萃取物，选用旋转蒸发仪在温度为45℃，真空度为0.04Mpa 的条件下对石油醚萃取物进行减压蒸馏对萃取物进行浓缩，浓缩后的萃取物用无水乙醇溶解得到混合溶液，将混合溶液在常压下、温度为40℃的条件下干燥12h，最后在真空度为0.06Mpa、干燥温度为40℃的条件下干燥10h后得到干燥石油醚萃取物。

本实施例制备得到的喜旱莲子草石油醚提取物的体外抗癌实验，具体包括以下步骤：

（1）准备以下细胞株，试剂以及仪器：人非小细胞肺癌A549，人乳腺癌MCF-7；DMEM培养液（GIBCO），胎牛血清（GIBCO），胰蛋白酶（GIBCO），DMSO（分析纯，Amresco），青霉素(Sigma)，链霉素（Sigma），MTT （Amresco），96孔板，细胞培养箱（Thermo），酶标仪（Tecan），生物操作台（吴江市绿岛净化设备厂）。

（2）肿瘤细胞培养：基础培养基1640+10%FBS（胎牛血清）+1%双抗青链霉素，培养条件为37℃，5%CO₂浓度及饱和湿度；当细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶消化细胞，洗涤吹散细胞，以每孔3×10³个细胞 100μl接种于96孔板，以备MTT实验。

（3）细胞增殖实验（MTT法）：取本实施例制备得到的喜旱莲子草石油醚提取物溶于DMSO溶液，分别配置浓度为100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.5625mg/ml、0.78125mg/ml，共8个浓度每个浓度2倍稀释；每孔加入1μl各浓度石油醚提取物，并补加100μl培养基，混匀，使得喜旱莲子草石油醚提取物的每孔终浓度为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml；放入培养箱继续培养24h、48h、72h。每孔加入20μl MTT溶液，继续培养4h；培养4h后抽出每孔溶液后每孔加入100μl DMSO溶液，酶标仪下测定每孔的吸光度；以加入DMSO溶液1μl培养的细胞为对照组，每个浓度梯度设5个平行组，分别计算细胞抑制率；按照以下公式计算抑制率：

抑制率=(1-(实验组吸光度/对照组吸光度))×100%。

表1.不同浓度喜旱莲子草石油醚提取物对MCF-7细胞生长的抑制作用

表2.不同浓度喜旱莲子草石油醚提取物对A549细胞生长的抑制作用

实施例2

本实施例所述述喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）按喜旱莲子草和乙醇体积比为1:5的比例将喜旱莲子草浸入乙醇溶液中，通过超声提取法，提取至乙醇溶液颜色较淡或无色为止；

（2）收集提取液，采用旋转蒸发仪在温度为43℃，真空度为0.06Mpa的条件下对提取液进行减压蒸馏，浓缩乙醇超声提取物至无醇味；

（3）收集得到的乙醇超声提取物，按超声提取物与蒸馏水的体积比1:2，在超声提取物中加入蒸馏水混匀得到混合溶液，按混合溶液与石油醚的体积比为1:1的比例在混合溶液中加入石油醚进行多次萃取，直到石油醚萃取相无色；

（4）收集石油醚萃取物，选用旋转蒸发仪在温度为48℃，真空度为0.05Mpa 的条件下对石油醚萃取物进行减压蒸馏对萃取物进行浓缩，浓缩后的萃取物用无水乙醇溶解得到混合溶液，将混合溶液在常压下、温度为50℃的条件下干燥8h，最后在真空度为0.08Mpa、干燥温度为50℃的条件下干燥8h后得到干燥石油醚萃取物。

本实施例制备得到的喜旱莲子草石油醚提取物的体外抗癌实验，具体步骤同实施例1，本实施例结果见表3，4。

表3.不同浓度喜旱莲子草石油醚提取物对MCF-7细胞生长的抑制作用

表4.不同浓度喜旱莲子草石油醚提取物对A549细胞生长的抑制作用

实施例3

本实施例所述述喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）按喜旱莲子草和乙醇体积比为1:2的比例将喜旱莲子草浸入乙醇溶液中，通过超声提取法，提取至乙醇溶液颜色较淡或无色为止；

（2）收集提取液，采用旋转蒸发仪在温度为48℃，真空度为0.04Mpa的条件下对提取液进行减压蒸馏，浓缩乙醇超声提取物至无醇味；

（3）收集得到的乙醇超声提取物，按超声提取物与蒸馏水的体积比1:1，在超声提取物中加入蒸馏水混匀得到混合溶液，按混合溶液与石油醚的体积比为1:2的比例在混合溶液中加入石油醚进行多次萃取，直到石油醚萃取相无色；

（4）收集石油醚萃取物，选用旋转蒸发仪在温度为43℃，真空度为0.06Mpa 的条件下对石油醚萃取物进行减压蒸馏对萃取物进行浓缩，浓缩后的萃取物用无水乙醇溶解得到混合溶液，将混合溶液在常压下、温度为45℃的条件下干燥10h，最后在真空度为0.07Mpa、干燥温度为45℃的条件下干燥12h后得到干燥石油醚萃取物。

本实施例制备得到的喜旱莲子草石油醚提取物的体外抗癌实验，具体步骤同实施例1，本实施例结果见表5、6。

表5.不同浓度喜旱莲子草石油醚提取物对MCF-7细胞生长的抑制作用

表6.不同浓度喜旱莲子草石油醚提取物对A549细胞生长的抑制作用

实施例1结合之前的实施例2，3结果，得到下面的图1，2，3，4所示的结果。通过表1，3，5可以看出喜旱莲子草的石油醚萃取物对于MCF-7乳腺癌细胞具有抑制作用，且抑制作用与用药剂量成正比关系。

通过表2，4，6可以看出喜旱莲子草的石油醚萃取物对于A549非小细胞肺癌细胞具有抑制作用，且抑制作用与用药剂量成正比关系。

通过图1，2可以说明喜旱莲子草的石油醚萃取物对MCF-7乳腺癌细胞及A549非小细胞肺癌细胞的抑制作用成剂量-时间效应关系，随着用药时间以及浓度的增加，其对这两种癌细胞的抑制作用也随之增加，成正比关系。

通过图3，4可以得出喜旱莲子草的石油醚萃取物对于MCF-7乳腺癌细胞以及A549非小细胞肺癌细胞的抑制曲线，并且可以计算出相对应的IC50值，分别为30.11μg/ml，9.075μg/ml 。

一种喜旱莲子草石油醚提取物的制备方法及运用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。