专利摘要

本发明涉及医药技术领域，公开了一种香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB的抗菌应用。本发明首次提供了化学合成的方法得到黄绵马酸BB化合物，其具有良好的抗菌应用，有效填补抗菌天然化合物的应用不足，尤其是针对耐药性细菌提供有效地抗菌解决方案。实验结果显示，本发明所得化合物具有较强的抗细菌作用，尤其是针对耐药性细菌，疗效良好。

权利要求

1.香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB在制备抗细菌感染药物方面的应用，所述香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸的结构如式(Ⅰ)所示：

其特征在于，所述抗细菌感染药物为抗对达托霉素产生耐药性的金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。

说明书

技术领域

本发明涉及化学和医药技术领域，更具体地，涉及一种香鳞毛蕨间苯三酚 类化合物黄绵马酸BB及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性致病菌。人类是金黄 色葡萄球菌的主要携带者之一，健康人群能够携带20％，分布在皮肤、上呼吸道 等部位。机体免疫力不足的情况下，侵袭机体转变为内源性感染，引发包括脑 膜炎、败血症、心内膜炎及骨髓炎等在内的全身性感染和局部化脓性感染，是 医院及社区感染中最常见的致病菌之一。近年来美国疾病控制中心报告表明， 由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌，研究提供能够抗革 兰氏阳性致病菌尤其是金黄色葡萄球菌具有重要的医院及社区临床应用意义。

进一步地，随着临床上抗生素的广泛使用，细菌产生了多种耐药机制使其对 抗细菌药物的敏感性大大降低，因此继续寻找高效、低毒性、甚至全新作用靶 点的天然抗细菌药物仍是当下抗细菌药物发现研究的发展方向。

香鳞毛蕨作为一种民间用药，其应用广泛且效果显著。根据民间验方记载， 香鳞毛蕨本身对很多种的皮肤病具有很好的疗效，例如牛皮癣、头癣、脚气等。 通过研究香鳞毛蕨各种水煎液对皮肤病的治疗效果发现，香鳞毛蕨的水煎液对 多种皮肤病具有明显的治疗效果，尤其是浅部真菌引起的皮癣、脚癣等。研究 发现香鳞毛蕨不同提取溶剂的提取物抗菌效果对比发现，香鳞毛蕨乙醇提取物 效果很好。现代药理学研究表明，香鳞毛蕨对体外的真菌及细菌均具有较强的 抑制作用。

本申请人长期的研究总结发现香鳞毛蕨抗皮肤真菌的活性成分为间苯三酚 类化合物及衍生物，其中黄绵马酸BB具有较高抗真菌药物活性，但是其抗细菌 尤其是在制备治疗耐药性细菌的药物方面目前未见技术报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对从香鳞毛蕨高效分离制备得到的间苯三酚 类化合物黄绵马酸BB的应用技术不足，提供香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马 酸BB的抗细菌应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB在制备抗细菌感染药物方面的 应用，所述香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸的结构如式(Ⅰ)所示:

所述香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB尤其在制备抗革兰氏阳性致 病菌感染药物方面具有更为显著和全新的应用。

优选地，针对金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的应用效果优良。

所述香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB抗具耐药性的革兰氏阳性致 病菌感染药物方面显现更为独特和首要发现的良好应用。

尤其是可以很好地应用于制备抗具耐药性的革兰氏阳性致病菌感染药物 方面。所述药物包括但不限于头孢唑啉、万古霉素和/或达托霉素。

应用效果更为显著的是，所述耐药性革兰氏阳性致病菌为耐药的金黄色 葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。

作为优选，本发明同时提供了所述香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸 BB的化学合成方法，包括以下步骤：

S1.合成2’,4’,6’-三羟基-3’-丁酰基苯丁酮；

S2.合成4,4-二甲基-3,5-二羟基-2,6-二丁酰基-2,5-环己二烯酮；

S3.合成4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-2,5-环己二烯酮；

S4.合成2,4,6-三甲氧基苯甲醛；

S5.合成2-甲基,3,5-二甲氧基苯甲醚；

S6.合成3’-甲基-2’,4’,6’-三甲氧基苯丁酮；

S7.合成3’-甲基-2’,4’,6’-三羟基苯丁酮；

S8.合成4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-6-(5-甲基-2,4,6-三羟基 -3-丁酰基苄基)-2,5-环己二烯酮。

进一步地，所述香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB的化学合成方法， 包括以下步骤：

S1.合成2’,4’,6’-三羟基-3’-丁酰基苯丁酮；

将化合物间苯三酚溶于三氟化硼乙醚中，加入正丁酸，油浴100℃下反应， 反应结束后，将反应液倒入醋酸钾溶液中，二氯甲烷萃取，合并有机层，洗涤， 干燥，浓缩后柱层析得2’,4’,6’-三羟基-3’-丁酰基苯丁酮；

S2.合成4,4-二甲基-3,5-二羟基-2,6-二丁酰基-2,5-环己二烯酮；

将2’,4’,6’-三羟基-3’-丁酰基苯丁酮溶于甲醇中，分批加入叔丁醇 钾，再加入碘甲烷反应，反应结束往反应液中加入稀盐酸调至酸性，二氯甲烷 萃取，合并有机层，洗涤，干燥，浓缩后可直接投于下一步无需纯化，或柱层 析(PE/EA80:1,v/v)得4,4-二甲基-3,5-二羟基-2,6-二丁酰基-2,5-环己 二烯酮；

S3.合成4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-2,5-环己二烯酮；

将4,4-二甲基-3,5-二羟基-2,6-二丁酰基-2,5-环己二烯酮加入到硫酸 溶液中，反应后将反应液倒入冰水中，二氯甲烷萃取，合并有机层，洗涤，干 燥，浓缩后柱层析得4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-2,5-环己二烯酮；

S4.合成2,4,6-三甲氧基苯甲醛；

将化合物原料1,3,5-三甲氧基苯和草酰氯溶于无水二氯甲烷中，冰浴下 加入无水DMF，室温反应；反应结束后，将反应液倒入饱和碳酸氢钠溶液中，二 氯甲烷萃取，合并有机层，洗涤，干燥，浓缩得2,4,6-三甲氧基苯甲醛；

S5.合成2-甲基,3,5-二甲氧基苯甲醚；

将2,4,6-三甲氧基苯甲醛溶于四氢呋喃中，分批加入氰基硼氢化钠，室 温反应，反应结束后，二氯甲烷萃取，合并有机层，洗涤，干燥，浓缩后柱层 析得2-甲基,3,5-二甲氧基苯甲醚；

S6.合成3’-甲基-2’,4’,6’-三甲氧基苯丁酮；

将2-甲基,3,5-二甲氧基苯甲醚和正丁酰氯溶于无水二氯甲烷中，冰浴下 分批加入三氯化铝，室温反应，反应结束后，将反应液倾倒入浓盐酸的冰水溶 液中，乙酸乙酯萃取，合并有机层，饱和碳酸氢钠洗，洗涤，干燥，浓缩后柱 层析，得3’-甲基-2’,4’,6’-三甲氧基苯丁酮；

S7.合成3’-甲基-2’,4’,6’-三羟基苯丁酮；

将3’-甲基-2’,4’,6’-三甲氧基苯丁酮溶于无水甲苯中，加入无水氯 化铝，氮气氛下回流反应，反应结束后，将反应液倾倒入浓盐酸的冰水溶液中， 乙酸乙酯萃取，合并有机层，氢氧化钠萃取，合并水层，调pH，乙酸乙酯萃取， 合并有机层，洗涤，干燥，浓缩后柱层析得3’-甲基-2’,4’,6’-三羟基苯丁 酮；

S8.合成4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-6-(5-甲基-2,4,6-三羟基 -3-丁酰基苄基)-2,5-环己二烯酮；

将4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-2,5-环己二烯酮溶于二氯甲烷中， 加入N,N-二甲基亚甲基碘化铵，氮气保护下冰浴反应，反应结束后，加入3’- 甲基-2’,4’,6’-三羟基苯丁酮，回流反应，反应结束后，调pH，二氯甲烷萃 取，合并有机层，洗涤，干燥，浓缩后柱层析得黄绵马酸BB。本发明所述化学 合成方法制备得到的黄绵马酸BB与头孢唑啉等相比，具有更高的抗耐药细菌的 活性。

本发明的有益效果：

本发明提供了间苯三酚类化合物黄绵马酸BB，有效填补抗菌天然化合物的 应用不足，尤其是针对耐药性细菌提供有效地抗菌解决方案。

本发明采用临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的《产孢丝状真菌的液基 稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A2)及《需氧菌的稀释法抗菌药物敏 感性试验方案》(M07-A9)测定化合物的抗菌活性，实验结果显示，本发明所得 化合物具有较强的抗细菌作用，尤其是针对耐药性细菌，疗效良好。

本发明提供了一种新的制备黄绵马酸BB的途径和方法，简单易行，得率更 高，制备得到的化合物黄绵马酸BB在抗耐药细菌方面具有更高的活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，应当理解，此处所描述的具体实例 仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、 方法和设备为本领域常规来源和使用的试剂、方法和设备。

实施例1 间苯三酚类化合物黄绵马酸BB的分离制备

S1.香鳞毛蕨总间苯三酚类化合物的提取：将香鳞毛蕨干燥粗粉10千克用 10倍体积50％食用乙醇冷浸提取2次，每次各24h，减压浓缩回收乙醇至无醇味 得样品水溶液；

S2.用盐酸调节pH为1.5～4.5，静置12～18h，离心得到沉淀下来的浸膏 1.2kg。

S3.将S2所得沉淀浸膏样品溶解后，用硅胶拌样，进行硅胶色谱柱初步分 离，依次采用不同比例的石油醚-丙酮(100:1～1:1)，得到相应的组分Fr-A～E。

所述硅胶色谱柱采用硅胶(60～100目)拌样后，进行硅胶(200～300目) 柱色谱分离，Fr-B用石油醚-丙酮(100:1～50:1)梯度洗脱。TLC分析后合并 相似流份。

S4.取组分B样品，充分溶解于乙酸乙酯中，取硅胶(60～100目)拌样后， 进行硅胶(200～300目)柱色谱分离，石油醚-丙酮(100:1～50:1)梯度洗脱， TLC分析后合并相似流份，得4个组分Fr-B1～B4。Fr-B1～B4经过反复硅胶色 谱、凝胶、重结晶纯化得到化合物。

所述硅胶采用小硅胶色谱柱(200～300目)分离，Fr-B4用石油醚-丙酮 (100:1～80:1)梯度洗脱，所述葡聚糖凝胶分离的工艺条件为SephadexLH-20 凝胶柱，氯仿-甲醇(1:1)洗脱，合并相同流份；所述重结晶的工艺条件为石 油醚溶解后加入少量甲醇后沉淀析出，得到结晶；

S5.经半制备液相得到纯度较高的化合物FlavaspidicacidBB，所述半制 备液相制备方法的工艺条件：采用80％甲醇，V＝8mL/min，λ＝292nm。制备得到 的化合物经过高液相色谱检测(HPLC)，面积归一化法计算，其纯度为>98％。

实施例2 间苯三酚类化合物黄绵马酸BB的化学合成

目前化合物黄绵马酸BB的获取途径主要是从植物中分离提纯，分离制备比 较繁琐，产率低下。本实施例首次提出黄绵马酸BB的化学合成途径和设计，可 以大量且快速得到化合物。本实施例采用以间苯三酚(化合物1)为起始原料进 行反应，经氟-克酰化反应，碘甲烷甲基化，单脱丁酰基得中间体4。

以环保的试剂草酰氯和DMF反应生成vilsmeier试剂，再与原料1,3,5-三 甲氧基苯(5)反应，利用氰基硼氢化钠作还原剂，以90％的产率得到化合物7， 再通过傅克酰化反应以89％的产率得到化合物8，经AlCl3脱保护得到化合物9， 以Eschenmoser’s salt活化反应得到目标化合物黄绵马酸BB。该合成路线所 涉及的反应试剂均较为环保、经济，且适合于放大生产，获得纯的黄绵马酸BB。

合成路线如下：

合成步骤如下：

2’,4’,6’-三羟基-3’-丁酰基苯丁酮(化合物2)

将化合物1(100mg,0.79mmol)溶于三氟化硼乙醚(10mL)中，加入正 丁酸(218μL,2.38mmol)，油浴100℃下反应3h。TLC监测反应结束后，将 反应液倒入5％醋酸钾溶液(20mL)中，二氯甲烷萃取(25mL×3)，合并有机 层，水洗，饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，浓缩后柱层析(CH2Cl2/MeOH 300: 1,v/v)得黄色固体2(180mg,85.3％)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz),δ(ppm): 16.21(s,1H),12.99(s,1H),5.79(s,1H,Ar-H),2.89(t,J＝7.2Hz, 4H),1.47-1.54(m,4H),0.82(t,J＝7.35Hz,6H).

4,4-二甲基-3,5-二羟基-2,6-二丁酰基-2,5-环己二烯酮(化合物3)

将化合物2(50mg,0.19mmol)溶于甲醇中，分批加入叔丁醇钾(85mg, 0.76mmol)，再加入碘甲烷(35μL,0.56mmol)，30℃下反应24h。补加叔 丁醇钾(64mg,0.57mmol)和碘甲烷(35μL,0.56mmol)，继续反应12h。 TLC监测反应结束往反应液中加入1N稀盐酸调至酸性，二氯甲烷萃取(25mL ×3)，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后可直接投 于下一步无需纯化，或柱层析(PE/EA80:1,v/v)得黄白色固体3(35mg,63.3％)。 1HNMR(DMSO-d6,300MHz),δ(ppm):2.90-2.98(m,4H),1.58-1.63(m, 4H),1.28(s,6H),0.94-0.97(m,6H)。

4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-2,5-环己二烯酮(化合物4)

将化合物3(100mg,0.34mmol)加入到80％硫酸溶液(10mL)中，80℃下 反应20min后将反应液倒入冰水中，二氯甲烷萃取(25mL×3)，合并有机层， 水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析(CH2Cl2/MeOH 300:1, v/v)得黄色固体4(48mg,63.0％)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz),δ(ppm): 18.42(s,1H),5.37(s,1H,Ar-H),2.82(t,J＝7.5Hz,2H),1.45-1.52 (m,2H),1.20(s,6H),0.85(t,J＝7.41Hz,3H)。

2,4,6-三甲氧基苯甲醛制备(化合物6)

将化合物原料1,3,5-三甲氧基苯(化合物5)(2g,11.89mmol)和草酰 氯(1.3mL,15.46mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，冰浴下用注射器缓 慢加入无水DMF(1.2mL,15.46mmol)，加毕升至室温反应30min。TLC监测 反应结束后，将反应液倒入饱和碳酸氢钠溶液中，二氯甲烷萃取(100mL×3)， 合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得黄色固体粗品2,4,6- 三甲氧基苯甲醛6(2.3g,100％)，粗品无需纯化，直接投于下一步。

2-甲基,3,5-二甲氧基苯甲醚制备(化合物7)

将化合物2,4,6-三甲氧基苯甲醛(6)(2.46g,12.54mmol)溶于四氢呋 喃(30mL)中，分批加入氰基硼氢化钠(2.36g,37.61mmol)，滴加2滴甲 基橙溶液，加入1N稀盐酸至溶液变为橙色。室温反应2h。TLC监测反应结束 后，二氯甲烷萃取(25mL×3)，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸 钠干燥，浓缩后柱层析(PE/EA20:1,v/v)得目标化合物黄色固体7(42mg, 46.2％)。1H NMR(CDCl3,300MHz),δ(ppm):6.06(s,2H,Ar-H),3.73(s, 9H),1.94(s,3H)。

3’-甲基-2’,4’,6’-三甲氧基苯丁酮制备(化合物8)

将化合物2-甲基,3,5-二甲氧基苯甲醚7(1.7g,9.33mmol)和正丁酰氯 (1.26mL,12.13mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，冰浴下分批加入三 氯化铝(1.62g,12.13mmol)，加毕室温反应24h。TLC监测反应结束后，将 反应液倾倒入浓盐酸的冰水溶液中，乙酸乙酯萃取(25mL×3)，合并有机层， 饱和碳酸氢钠洗，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析(PE/EA 20:1,v/v)得目标化合物黄色固体8(2.2g,92.3％)。1H NMR(CDCl3,300MHz),δ(ppm):6.25(s,1H,Ar-H),3.85(s,3H),3.79(s,3H),3.69(s, 3H),2.74(t,J＝7.26Hz,2H),2.06(s,3H),1.65-1.72(m,2H),0.96 (t,J＝7.38Hz,3H)。

3’-甲基-2’,4’,6’-三羟基苯丁酮制备(化合物9)

将化合物8(133mg,0.53mmol)溶于无水甲苯(10mL)中，加入无水氯 化铝(422mg,3.16mmol)，氮气氛下回流反应4h。TLC监测反应结束后，将 反应液倾倒入浓盐酸的冰水溶液中，乙酸乙酯萃取(25mL×3)，合并有机层， 1N氢氧化钠萃取(25mL×3)，合并水层，用1N稀盐酸调节pH至酸性，乙 酸乙酯萃取(25mL×3)，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥， 浓缩后柱层析(PE/EA6:1,v/v)得黄色固体3’-甲基-2’,4’,6’-三羟基 苯丁酮(9)，(79mg,71.3％)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz),δ(ppm):14.04 (s,1H),10.51(s,1H),10.27(s,1H),6.00(s,1H,Ar-H),2.97(t,J ＝7.2Hz,2H),1.83(s,3H),1.54-1.66(m,3H),0.91(t,J＝7.32Hz, 3H)。

4,4-二甲基-3,5-二羟基-2-丁酰基-6-(5-甲基-2,4,6-三羟基-3-丁酰基苄 基)-2,5-环己二烯酮(黄绵马酸BB)

将化合物4(50mg,0.22mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入N,N-二 甲基亚甲基碘化铵(41mg,0.22mmol)，氮气保护下冰浴0℃反应2h。TLC监 测反应结束后，加入化合物9(47mg,0.22mmol)，回流反应12h。TLC监测 反应结束后，加入1N稀盐酸调节pH至酸性，二氯甲烷萃取(25mL×3)，合 并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析(PE/acetone 80:1,v/v)得白色固体黄绵马酸BB(54mg,57.9％)。1H NMR(CDCl3,300M Hz),δ(ppm):15.95(s,1H),11.47(s,1H),10.08(s,1H),5.51(s,1H), 3.56(d,J＝11.1Hz,2H),3.24–3.02(m,4H),2.12(s,3H),1.72(dq, J＝10.7,7.3Hz,4H),1.57–1.36(m,6H),1.01(td,J＝7.4,3.2Hz, 6H).ESI-MSm/z446.21[M+H]+。

实施例3 香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB的体外抗浅部真菌作用实验

(1)犬小孢子菌(CMCC(F)T5C)、糠秕马拉色菌(CMCC(F)T17a)、石膏样小孢 子菌(CMCC(F)M2C)，由中国医学科学院皮肤病研究所(南京)提供。皮肤癣菌的 微量稀释法按美国CLSI制定的M38-A2方案进行，简述如下：用接种环轻刮SDA 培养基表面菌落，使用无菌研磨器将菌丝研碎，将皮肤癣菌悬浮于无菌生理盐 水中，调整浊度至0.5麦氏浊度，并用血细胞计数板计数孢子数量及短菌丝数。 使菌液浓度为1×103CFU/mL至3×103CFU/mL。即用RPMI-1640液体培养基将0.5 麦氏浊度菌液稀释1000倍，并以血细胞计数板计数为准，得接种菌液。使用 RPMI-1640液体培养基稀释的香鳞毛蕨单体贮备液(20μg/mL)于96孔板第一列，使用培养基进行横向2倍稀释至第10列，第11列加入100μLRPMI-1640 液体培养基，第12列加入200μLRPMI-1640液体培养基。然后再于第1列至第 11列加入接种菌液100μL。此时，第1-10列为梯度药物孔，单体浓度为20μg/mL 至0.039μg/mL，且各孔中抗菌药物第11列为生长对照孔，第12列为阴性对照 孔。将96孔板置于35℃恒温孵育后，以肉眼观察，视相当于生长对照产生了80％生长抑制的药物浓度为MIC。在此基础上，吸取MIC所在孔及其高浓度的菌 液50μL于沙氏培养基上，35℃恒温孵育后，以肉眼观察，以没有出现菌落生长 的浓度为MFC。

此外，在每次测定时应进行质量控制，QC株采用近平滑念珠菌(ATCC 22019)， 质控药物为伊曲康唑，在平行操作条件下，QC株的MIC应在0.03～0.12μg/mL 范围内，如此则视为测定结果有效可信。

各菌株按以上操作平行重复测定四次，计算MIC和MFC的几何平均数。

结果判读参考CLSI的M38-A2方案，肉眼观察评分法来判定孔内真菌生长情 况，按以下标准记录实验结果：各孔均与生长对照孔相比完全澄清(100％生长 抑制)，-；与生长对照孔相比略微模糊为(75％生长抑制)，+；与生长对照孔相 比浊度显著降低(50％生长抑制)，++；与生长对照孔相比浊度略有降低，(25％ 生长抑制)，+++；浊度与生长对照孔相当，即浊度无降低(无生长抑制)，++++。 本实验取与生长对照孔相比80％生长抑制所对应的最低药物浓度为MIC值，实验 结果见表1所示。

表1.香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB体外抗皮肤癣菌的作用研究 (μg/mL)

实验结果表明，受试菌对黄绵马酸BB的敏感程度为：糠秕马拉色菌＞石膏 样小孢子菌＞犬小孢子菌。黄绵马酸BB单体对糠秕马拉色菌具有较强的抑制作 用，效果优于硝酸咪康唑。4种受试药物对糠秕马拉色菌的MFC均大于测试浓度。 相比于阳性药物，犬小孢子菌和石膏样小孢子菌对黄绵马酸BB的敏感性较差。

实施例4 香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB的体外抗细菌作用实验

表面葡萄球菌标准株(ATCC14990)由广东药科大学基础学院提供；金黄色 葡萄球菌临床分离株1～3(MRSA1、2、3)，由广州医科大学呼吸病研究所提供。 细菌的微量稀释法按照美国CLSI制定的M07-A9方案进行。简述如下，用CAMHB 培养基悬浮营养琼脂培养基表面的菌落，并调整浊度至0.5麦氏浊度(1× 108CFU/mL)。使用CAMHB培养基稀释上述菌液浓度至1×106CFU/mL作为接种菌 液。使用CAMHB培养基稀释药物贮备液至特定浓度，加200μL药物贮备液于96 孔板第一列，使用培养基进行横向2倍稀释至第10列，第11列加入100μL培养基，第12列加入200μL。再与第1列至第11列加入接种菌液100μL。此时， 第1至第10列为梯度药物孔，第11列为生长对照孔，第12列为阴性对照孔。 将96孔板置于35℃恒温孵育18～24h后，以肉眼观察，视无菌生长的浓度为 MIC。在此基础上，吸取MIC所在孔及其高浓度的菌液50μL于琼脂培养基上， 35℃恒温孵育18～24h后，以肉眼观察，以没有出现菌落生长的浓度为MBC。

此外，在每次测定时应进行质量控制，QC株采用金黄色葡萄球菌 (ATCC@29213)，头孢唑啉为质控药物，在平行操作的条件下，QC株的MIC应在 0.25～1μg/mL范围内，如此可视为测定结果有效可信。

各菌株按以上操作平行重复操作两次，计算MIC和MBC的几何平均数。

表2.香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB体外抗细菌的作用研究 (μg/mL)

注：SA为金黄色葡萄球菌标准株；MRSA1、MRSA2、MRSA3均为金黄色葡萄球 菌临床分离株；SE为表皮葡萄球菌标准株。“-”表示无相关数据。

结果表明，阳性药头孢唑啉对受试的3株金黄色葡萄球菌临床分离株的MIC 分别为320、320、640μg/mL，相比于标准株的MIC(0.71μg/mL)扩大了450倍， 表现出高度耐药。黄绵马酸BB对表皮葡萄球菌的标准株、金黄色葡萄球菌的标 准株和3株临床分离的耐药株的最小抑菌浓度分别为10、10、20、20和20μg/mL， 效果与阳性药万古霉素相当。由此可知，黄绵马酸BB具有显著的抗金黄色葡萄 球菌作用和抗MRSA作用。同时，黄绵马酸BB单体相应的最小杀菌浓度分别为 10、10、20、40和20μg/mL，最小抑菌浓度和最小杀菌浓度相接近，表明黄绵 马酸BB对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌不仅具有较好的抑菌作用还具有杀菌 作用。具有杀菌作用的药物出现耐药现象的频率往往更低，提示黄绵马酸BB具 有开发成为新型抗菌药物的潜力。

香鳞毛蕨间苯三酚类化合物黄绵马酸BB及其抗菌应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。