专利摘要

本发明公布了一种可以在近红外区域(800‑1600nm)对pH进行强度和寿命响应的稀土配合物及其制备和应用。该化合物包括全氟代四吡咯有机配体，稀土离子和轴向配体。此类化合物具备优越的生物相容性，发光强度和寿命都随着pH的改变而有明显的变化，是潜在的活体强度和寿命成像试剂和pH检测药物。

权利要求

1.一种稀土配合物，由氟代四吡咯有机配体，稀土离子和轴向配体组成，其结构式如下图所示：

其中，Ln代表稀土离子，选自Yb、Nd、Er、Pr、Tm和Ho中的一种或多种；

L为氟代四吡咯配体，

R1,R2,R3,R4为芳环，R1,R2,R3,R4各自独立地包含一个或多个酸性苯环，酸性基团取代位置为以下结构中的任意一种，

酸性基团R’选自磷酸基、烷基磷酸基、羧基、烷羧基、磺酸基、烷基磺酸基中的任意一种；

A代表两齿或三齿的轴向多齿配体，配位原子为氧、氮或硫、硒，所述轴向多齿配体为氘代或卤代的三脚架配体；

其中，为中的一种，RN1RN2,RN3各自选自氢、烷基、烷氧基、卤素取代烷基、取代氨基或烷硫基，所述取代氨基为C1～C12烷基取代氨基。

2.如权利要求1所述的稀土配合物，其特征在于，所述卤素选自F、Cl、Br和I中的一种或多种；所述烷基为C1～C12烷基；所述烷氧基为C1～C8烷氧基；所述卤素取代烷基为一个或多个卤素取代的C1～C12烷基；所述烷硫基为C1～C8烷基取代巯基。

3.如权利要求1所述的稀土配合物，其特征在于，所述烷基磷酸基为C1～C8烷基取代磷酸基。

4.根据权利要求1所述的稀土配合物，其特征在于，所述稀土配合物的结构选自以下结构中的任意一种或多种：

5.权利要求1所述的稀土配合物的制备方法，包括：

1)在非氧化性气氛条件下，使氟代四吡咯卟啉配体和稀土盐在第一有机溶剂中以及100～300℃下反应，获得第一中间产物；

2)使所述第一中间产物和轴向配体在第二有机溶剂中进行反应，得到溶于有机相的第二中间产物；

3)通过对第二中间产物在第三有机溶剂中进行水溶性修饰反应，得到所述带酸性基团的稀土配合物。

6.根据权利要求5所述稀土配合物的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂选自三氯苯、十氢萘、二甲基亚砜、邻二氯苯、正己醇和甲苯组成的组中的任意一种或多种的混合物，所述非氧化性气氛为氮气气氛、氩气气氛、真空环境气氛、氦气气氛、氢气气氛或氮氢混合气气氛；所述第二有机溶剂选自氯仿、丙酮、二甲基亚砜、邻二氯苯、正己醇和甲苯组成的组中的任意一种或多种的混合物；所述第三有机溶剂为甲醇、四氢呋喃、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮组成的组中的任意一种或多种的混合物。

7.根据权利要求6所述稀土配合物的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂选自三氯苯、十氢萘和二甲基亚砜组成的组中的任意一种或多种的混合物；所述非氧化性气氛为氮气气氛、氩气气氛或真空环境气氛；所述第二有机溶剂选自氯仿、丙酮、二甲基亚砜组成的组中的任意一种或多种的混合物；所述第三有机溶剂为甲醇、四氢呋喃、丙酮组成的组中的任意一种或多种的混合物。

8.权利要求1～4任一所述稀土配合物在制备近红外强度和寿命成像及pH检测试剂上的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物成像和探针领域，具体涉及在近红外二区对pH进行强度和寿命响应的稀土配合物及其制备方法和生物应用，其可以有效地实现近红外强度和寿命成像，并对细胞内pH变化实现有效检测。

背景技术

相比于传统近红外一区的染料(700-900nm)，近红外二区(900-1200nm)的染料可以实现更深层次的组织成像(Cheng Z,et al.Chem.Soc.Rev.,2018,DOI:10.1039/c8cs00234g；Dai H,et al. Nat.Biomed.Eng.,2017,1,0010)。但目前已报道的近红外二区染料只实现了荧光强度成像的研究，并且发光量子产率较低，寿命较短，限制了它们作为近红外生物探针的应用(Wan H,Yue J,Zhu S,et al.Nat.Commun.2018,9,1171； I,Eliseeva S V,Nguyen T N,et al.J.Am.Chem.Soc. 2017,139,8388-8391；Lei Z,Li X,Luo X,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,2979-2983)。相比于荧光强度成像，荧光寿命成像可以有效地排除组织自发荧光/染料发光量子产率低/光漂白等的影响，实现对外界环境改变的有效探测(Sarder P,Maji D,and Achilefu S.Bioconjugate Chem.2015,26,963-974)，这也是近红外二区染料亟待解决的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种新型的在近红外二区对pH进行强度和寿命响应的稀土配合物及其制备方法。它们发光量子产率高，寿命长，具备良好的生物相容性，对pH变化有显著的相应，是潜在的活体强度和寿命成像试剂和pH检测药物。

本发明所提供的稀土配合物，由氟代四吡咯有机配体、稀土离子和轴向配体组成，其结构式如下式所示。

其中，Ln代表稀土离子。L为氟代四吡咯配体，R1、R2、R3和R4各自独立选自不同的取代基。A代表轴向多齿配体(两齿或三齿)，配位原子为氧、氮或硫、硒。

所述Ln优选为Yb、Nd、Er、Pr、Tm和Ho中的一种或多种。

所述轴向配体为氘代或卤代的乙酰丙酮配体和/或氘代或卤代的 三脚架配体。

所述L为全氟代四吡咯配体，其中， 为 中的一种，R1,R2,R3,R4为芳环。

所述RN1,RN2,RN3各自独立选自氢、烷基、烷氧基、卤素取代烷基、取代氨基或烷硫基。

所述R1,R2,R3,R4为包含一个或多个酸性基团的取代苯环，取代位置为以下结构中的任意一种。

所述酸性取代基R’包括羧基、烷羧基、磺酸基、烷基磺酸基、磷酸基、烷基磷酸基中的任意一种。

所述R1,R2,R3,R4剩余苯环包含一个或多个(少于或等于3个)取代苯环

所述R1’—R5’各自独立选自氢、卤素、硝基、羟基、烷羟基、氨基、取代氨基、烷基、烷氧基、卤素取代烷基、巯基、烷硫基。

所述卤素选自F、Cl、Br和I中的一种或多种。

所述烷基优选为C1～C12烷基，更优选为C1～C6烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基等。

所述取代氨基优选为C1～C12烷基取代氨基，更优选为C1～C6烷基取代氨基，例如甲胺基、乙胺基、二甲胺基、二乙胺基等。

所述烷氧基优选为C1～C8烷氧基，更优选为C1～C4烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

所述卤素取代烷基优选一个或多个卤素取代的C1～C12烷基，更优选为一个或多个卤素取代的C1～C6烷基，例如三氟甲基等。

所述烷硫基优选C1～C8烷基取代巯基，更优选为C1～C4烷基取代巯基，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基等。

所述烷磺酸基优选为C1～C8烷基取代磺酸基，更优选为C1～C4烷基取代磺酸基，例如甲磺酸、乙磺酸、丙磺酸基等。

所述烷磷酸基优选为C1～C8烷基取代磷酸基，更优选为C1～C4烷基取代磷酸基，例如甲磷酸、乙磷酸、丙磷酸基等。

所述稀土配合物的结构选自以下结构中的任意一种或多种。

本发明还提供了一种所述稀土配合物的合成方法，该制备方法包括：1)在惰性气氛条件下，使氟代四吡咯卟啉配体和稀土盐在第一有机溶剂中以及100～300℃下反应，获得第一中间产物；2)使所述第一中间产物和轴向配体在第二有机溶剂中进行反应，得到溶于有机相的第二中间产物；3)通过对第一中间产物在第三有机溶剂中进行水溶性修饰反应，例如水解、离子化反应，得到所述带酸性基团的稀土配合物。

所述第一有机溶剂选自三氯苯、十氢萘、二甲基亚砜、邻二氯苯、正己醇和甲苯组成的组中的任意一种或多种的混合物，优选为三氯苯、十氢萘和二甲基亚砜组成的组中的任意一种或多种的混合物，优选所述非氧化性气氛为氮气气氛、氩气气氛、真空环境气氛、氦气气氛、氢气气氛或氮氢混合气气氛，优选为氮气气氛、氩气气氛或真空环境气氛；优选所述第二有机溶剂选自氯仿、丙酮、二甲基亚砜、邻二氯苯、正己醇和甲苯组成的组中的任意一种或多种的混合物，优选为氯仿、丙酮、二甲基亚砜组成的组中的任意一种或多种的混合物；所述第三有机溶剂为水、甲醇、四氢呋喃、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮组成的组中的任意一种或多种的混合物，优选甲醇、四氢呋喃、丙酮组成的组中的任意一种或多种的混合物。

本发明提供的稀土配合物对pH的改变有明显的响应，其中代表性配合物Yb-1对着pH 从8变化到5，发光强度和寿命都明显增强，差距达到10倍左右。该类稀土配合物具有较好的生物相容性，通过近红外激光共聚焦成像结合电感耦合等离子体发射光谱等手段，发现该化合物可以有效进入癌细胞，定位在溶酶体，在细胞内有较强的近红外发光信号和微秒级寿命。通过改变细胞的pH值,发现该类化合物在细胞内的发光强度和寿命都有明显的改变。

本发明提供的稀土配合物具备较好的组织穿透型，通过三维细胞球模拟实验发现，该类化合物可以有效进入肿瘤内部，实现近红外强度成像和寿命成像，并且对于模拟肿瘤外部pH 的改变，也可以实现强度和寿命响应，这意味着该类化合物有望作为近红外强度和寿命成像试剂和pH检测药物在临床诊断和治疗中得到应用。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1显示了本发明稀土配合物1和4的发射图谱；

图2显示了本发明稀土配合物3在不同pH溶液中的寿命比值变化和发光位置。

图3显示了本发明稀土配合物2在不同pH的3维人子宫颈癌细胞系HeLa细胞球中的发光强度。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明的技术方案，下面通过实施例进行详细阐述，进一步说明本申请的有益效果。但本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

所作的实验及效果如具体实施例所述，其中测试条件如下：

发光性能的测试是以波长为390～800nm范围内光激发实施例中的稀土配合物，并测量其发射光谱强度和寿命，溶剂选自二甲基亚砜。

实施例1配合物1的合成：

通过将对应的氟代四吡咯配体和乙酰丙酮镱盐混合在三氯苯中，在氮气气氛条件下200℃反应，获得第一中间产物。然后将得到的第一中间产物和相应的氘代的 三角架配体在氯仿中进行反应，获得了第二中间产物。再将第二中间产物在硫酸中反应得到配合物1。发射主峰位置见图1:920nm,950nm,980nm,1000nm,1020nm,1050nm；激发主峰位置:418 nm,560nm,620nm；寿命:约170μs。

实施例2配合物2的合成：

通过将对应的氟代四吡咯配体和乙酰丙酮镱盐混合在三氯苯中，在氮气气氛条件下200℃反应，获得第一中间产物。然后将得到的第一中间产物和相应的氘代的 三角架配体在氯仿中进行反应，获得了第二中间产物。再将第二中间产物在甲醇和四氢呋喃中通过氢氧化钾水解得到配合物2。发射主峰位置:920nm,950nm,980nm,1000nm,1020nm,1050nm；激发主峰位置:416nm,546nm,592nm；寿命:约150μs。

实施例3配合物3的合成：

通过将对应的氟代四吡咯配体和乙酰丙酮镱盐混合在三氯苯中，在氮气气氛条件下200℃反应，获得第一中间产物。然后将得到的第一中间产物和相应的氘代的 三角架配体在氯仿中进行反应，获得了第二中间产物。再将第二中间产物在(三甲基硅基)亚磷酸盐中反应得到配合物3。发射主峰位置:920nm,950nm,980nm,1000nm,1020nm,1050nm激发主峰位置:416nm,546nm,592nm；寿命：约140μs。

实施例4配合物4的合成：

通过将对应的氟代四吡咯配体和乙酰丙酮铒盐混合在三氯苯中，在氮气气氛条件下200℃反应，获得第一中间产物。然后将得到的第一中间产物和相应的氘代的 三角架配体在氯仿中进行反应，获得了第二中间产物。再将第二中间产物在甲醇和四氢呋喃中通过氢氧化钾水解得到配合物4。发射主峰位置见图1:1465nm,1487nm,1530nm,1566nm,1611nm；激发主峰位置:417nm,545nm,596nm；寿命:约10μs

实施例5

配合物Yb-2在癌细胞中的pH检测

在不同pH的PBS缓冲溶液中的测定结果发现，本专利合成的Yb-2化合物在近红外的发光强度和寿命都随着pH的改变而有明显的变化，如图2所示，因此将其应用于癌细胞中的 pH检测。细胞实验所用细胞系来源为北京大学。细胞在37℃恒温、含有5％CO2以及饱和水蒸气气氛的细胞培养箱内进行培养。所用培养基为含有10％胎牛血清，100μg/mL青霉素和100U/mL链霉素的高糖杜氏改良伊格尔培养基。细胞在六孔培养板中生长，隔天传代。细胞球的培养办法为将细胞传代至超低吸附96孔板中，每孔约含有25000个细胞以及200μL培养基。待2-3天成球后，将培养基换成含有10μM稀土配合物的完全培养基培养2-24h。细胞成像实验之前将培养基换成不同pH的PBS，并加入10μM尼日利亚菌素，培养30min以后在近红外共聚焦显微镜下观察。观察结果如图3所示，在不同的pH下,该化合物在细胞球中的发光强度有着明显的区别。随着pH的升高，配合物发光强度降低。并且我们也发现，细胞内的寿命和图2的类似，寿命随着pH的升高而变短。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

本申请的稀土配合物的发光范围覆盖近红外二区，发光寿命都在微秒级以上，并且当氟代四吡咯配体的结构和稀土离子发生变化时候，配合物发射峰、激发峰的位置、峰宽均有变化，说明选用不同配体和稀土离子组合可以实现发射峰、激发峰的可调可控，以适应不同的成像需求。

而且，本专利合成的此类稀土化合物不仅仅可以同时实现近红外二区的荧光强度成像和荧光寿命成像，并且由于此类化合物的发光强度和寿命都随着pH的改变而有明显的变化，因此可以实现在近红外二区pH的有效检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

具有近红外pH强度和寿命响应的稀土配合物专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。