专利摘要

本发明涉及一种糖基化氟硼二吡咯衍生物、表面糖修饰的纳米胶束及其制备方法和应用，该表面糖修饰的纳米胶束的制备方法如下：将糖基化氟硼二吡咯衍生物溶解在有机溶剂中配制成母液待用，另配制乳化剂的水溶液，将上述母液与乳化剂的水溶液配置成混合溶液，搅拌，充分混合后静置，透析，用透析冻干法制得所述表面糖修饰的纳米胶束，该表面糖修饰的纳米胶束在水溶液中具有高的稳定性，且具有良好的生物相容性，且能够特异识别癌细胞表面高表达的糖受体实现靶向输送光敏剂药物的目的，降低其对正常组织和皮肤光毒副作用，可作为输送各类光敏剂药物应用于光动力治疗癌症中。

权利要求

1.糖基化氟硼二吡咯衍生物，其特征在于，其化学结构式如式Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ所示：

2.表面糖修饰的纳米胶束，其特征在于，由权利要求1所述的糖基化氟硼二吡咯衍生物及乳化剂制得。

3.根据权利要求2所述的表面糖修饰的纳米胶束，其特征在于，所述乳化剂为吐温类乳化剂或司盘类乳化剂。

4.根据权利要求3所述的表面糖修饰的纳米胶束，其特征在于，所述吐温类乳化剂为Tween80、Tween20或Tween60中的一种，所述司盘类乳化剂为Span80、Span60或Span20中的一种。

5.权利要求2所述的表面糖修饰的纳米胶束的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：将糖基化氟硼二吡咯衍生物溶解在DMF中配制成1mg/mL母液待用，另配制体积浓度为0.01％-1％的乳化剂水溶液，母液与乳化剂的水溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌，充分混合后静置，透析，用透析冻干法制得所述表面糖修饰的纳米胶束。

6.权利要求2所述的表面糖修饰的纳米胶束在制备光动力治疗癌症药剂中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于表面糖修饰的纳米胶束技术领域，具体涉及一种糖基化氟硼二吡咯衍生物、表面糖修饰的纳米胶束及其制备方法和应用。

背景技术

光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是治疗肿瘤疾病的一种非侵入性技术。它需要具备三个基本要素光源、分子氧和光敏剂。其过程是特定波长的光照射使组织吸收的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。因而，光敏剂的光毒性决定了PDT的疗效。

第一代光敏剂主要为血卟啉衍生物，由于它在波长大于600nm的红外光区吸收较弱，导致光动力反应深度不能满足浸润较深的肿瘤治疗要求。另外，其具有不能充分地被光转为细胞毒性物质、需光照时间较长以及持续较长时间的皮肤光敏反应等缺点。现一些已进入临床试验阶段的第二代光敏剂主要包括卟啉衍生物、中介取代芳基卟吩类、酞菁类、叶绿素a降解产物衍生物以及血卟啉单甲醚等，它们具有结构单一、单态氧产率高、在红外区(波长650-800nm)有较强吸收等优点。但是由于它们的肿瘤靶向性不强，导致除肿瘤组织以外的正常组织，如皮肤等对光敏剂的吸收，使病人在接受了光动力治疗后仍需长时间避光以减轻皮肤红肿、色素沉着等光毒副作用。

目前PDT疗法的临床应用主要受限于光敏剂较差的水溶性和缺乏对肿瘤细胞的靶向性。例如，为提高光敏剂分子的肿瘤靶向性，人们在卟啉光敏剂分子中引入一些具有生物识别功能的效应分子，如单克隆抗体、多肽、叶酸等得到一些偶联光敏剂。这些效应分子虽在一定程度上提高了光敏剂的靶向性，但由于单克隆抗体组织渗透能力弱、制备方法复杂及可能的免疫原性使其应用受到限制；而大多数多肽化合物在体内的半衰期很短，生物利用率低，且只有少数的多肽受体在肿瘤细胞中有高表达，因而，多肽类靶向性光敏剂的应用同样受到极大的限制。

氟硼二吡咯衍生物具有优异的光物理性质，例如：良好的化学和光稳定性、低的光漂白、在长波处有高摩尔消光系数等等。另外，其含有多个利于化学修饰的反应位点，且其作用波长可通过合理修饰而到达PDT的最佳治疗窗口，故成为一类具有应用前景的第二代光敏剂。由于氟硼二吡咯衍生物为有机分子，不溶于水，因此，为了提高其水溶性和对肿瘤细胞的靶向性，研究人员对其进行了聚乙二醇修饰和叶酸修饰(可参考H.He,et.al.Journal of Medicinal Chemistry 2011,54,3097-3102；M.-R.Ke,et.al.Journal of Medicinal Chem istry 2013,56,8475-8483)。然而，这些经过聚乙二醇和叶酸修饰的氟硼二吡咯衍生物在水中仍然不具有高的稳定性，易聚集和沉降，使用时需要添加1％DMSO增加其在水中稳定性。由于DMSO具有较强细胞毒性，导致这些靶向光敏剂静脉注射给药和皮下给药使用受到限制。

在公告号为CN103755753A的中国发明专利中公开了一种糖基化氟硼二吡咯衍生物及其制备方法，其是将葡萄糖共价键连到氟硼二吡咯衍生物上，生物活性实验表明，被葡萄糖修饰后，光敏剂的肿瘤靶向性得到了明显提高。然而，由于该类糖基化氟硼二吡咯衍生物的水溶性较差，在与细胞共培养时需1％DMSO增加其在水中溶解性，而DMSO具有较强细胞毒性，导致这些靶向光敏剂静脉注射给药和皮下给药使用受到限制。为此，研制既有满意的光动力肿瘤靶向性，在水中更有良好的稳定性，对提高肿瘤光动力疗法的疗效具有十分重要的理论和临床意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种糖基化氟硼二吡咯衍生物、表面糖修饰的纳米胶束及其制备方法和应用，该表面糖修饰的纳米胶束在水溶液中具有高的稳定性，且具有良好的生物相容性。

本发明采用如下技术方案：

糖基化氟硼二吡咯衍生物，其化学结构式如式Ⅰ所示：

其中，式Ⅰ中的Z₁为单糖、二糖、寡糖、或连接有荧光标记物的寡糖的功能片段，Z₂为单糖、二糖、寡糖、或连接有荧光标记物的寡糖的功能片段，Z为单糖、二糖、寡糖、或连接有荧光标记物的寡糖的功能片段；

b为酯键(—COO—)、酰胺键(—CONR₁—)、二硫键(—S—S—)、醚键(—O—)、碳氮键(—C—N(R₂)—)、1,3-三氮唑环 或 中的一种；

式1中包含乙二醇的重复单元结构，其中n₁和n₂为相等或不等的重复单元数，其数值为1-4。

更进一步地，所述R₁＝H或CH₃，所述R₂＝H，CH₃或CH₃CH₂。

更进一步地，述单糖为甘露糖、葡萄糖、半乳糖或果糖中的一种；所述二糖为麦芽糖、蔗糖或乳糖中的一种；所述寡糖为含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖的寡糖片段或壳寡糖中的一种。

更进一步地，其化学结构式如式Ⅱ所示：

本发明提供一种表面糖修饰的纳米胶束，由上述的糖基化氟硼二吡咯衍生物及乳化剂制得。

更进一步地，所述乳化剂为吐温类乳化剂或司盘类乳化剂。

更进一步地，所述吐温类乳化剂为Tween 80、Tween 20或Tween 60中的一种，所述司盘类乳化剂为Span80、Span60或San20中的一种。

本发明提供所述的表面糖修饰的纳米胶束的制备方法，步骤如下：将糖基化氟硼二吡咯衍生物溶解在有机溶剂中配制成母液待用，另配制乳化剂的水溶液，将上述母液与乳化剂的水溶液配置成混合溶液，搅拌，充分混合后静置，透析，用透析冻干法制得所述表面糖修饰的纳米胶束。

更进一步地，具体步骤如下：将糖基化氟硼二吡咯衍生物溶解在DMF中配制成1mg/mL母液待用，另配制体积浓度为0.01％-1％的乳化剂水溶液，母液与乳化剂的水溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌，充分混合后静置，透析，用透析冻干法制得所述表面糖修饰的纳米胶束。

本发明提供一种所述的表面糖修饰的纳米胶束在制备光动力治疗癌症药剂中的应用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1)本发明制备的表面糖修饰的纳米胶束在良好的生物溶剂中形成的粒子为球形，且粒径分布均匀(见附图1)。在无光照情况下，纳米胶束分别与人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人正常乳腺上皮MCF-10A细胞共同孵育24小时，细胞存活率均高于90％(见附图2)。并且纳米胶束能够特异性识别乳腺癌MDA-MB-231细胞表面的甘露糖受体，通过受体识别作用选择性被乳腺癌MDA-MB-231细胞摄入后进入细胞溶酶体(见附图3)，进而在特定波长的光照下，光敏药物被激发而诱导单线态氧的产生(见附图4)，并杀伤细胞使细胞收缩且细胞核受损(见附图5)。另外，我们利用本发明制备纳米胶束的方法，尝试将公告号为CN103755753A中国发明专利中的糖基化氟硼二吡咯衍生物制备胶束，从透射电子显微镜照片结果显示并未得到粒径均匀的纳米胶束，且聚集现象严重(见附图6)；

2)本发明制备得到的表面糖修饰的纳米胶束在水溶液中为球形，且粒径分布均匀，具有高的稳定性；

3)传统光敏剂药物水溶性差，且缺乏对肿瘤细胞的靶向性。因此，在光照治疗时，激发光敏剂产生的活性氧对正常组织和细胞造成较大的毒副作用。而本发明表面糖修饰的纳米胶束由糖基化氟硼二吡咯衍生物和乳化剂共组装形成，其能够稳定分散在水溶液、细胞培养液或生理盐水中，具有良好的生物相容性。在实验条件下，该种胶束和人乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育24小时，暗环境下细胞存活率高于90％；

4)本发明表面修饰甘露糖类的纳米胶束，能够特异识别乳腺癌MDA-MB-231细胞表面的甘露糖受体，通过甘露糖受体识别作用选择性被乳腺癌MDA-MB-231细胞摄入，进而在特定665nm波长的LED灯(20mW/cm²)光照下，光敏剂BTM被激发而诱导活性氧的产生，并抑制癌细胞生长；而中国发明专利CN103755753A中的糖基化氟硼二吡咯衍生物制备的纳米胶束，与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养后，内吞进入乳腺癌细胞量较少，而且LED光照(665nm，20mW/cm²)后并未发现明显细胞核受损(见附图7)。

附图说明

图1为表面糖修饰的纳米胶束的透射电镜照片；

图2为乳腺癌MDA-MB-231细胞和乳腺上皮MCF-10A细胞在不同浓度纳米胶束存在条件下培养24小时后的相对存活率；

图3为荧光共聚焦显微镜照片证明纳米胶束通过细胞表面糖受体介导方式内吞进入乳腺癌MDA-MB-231细胞的溶酶体中，A：LysoTracker染色的细胞溶酶体；B：BTM荧光成像；C：前两种成像的合并图；

图4为荧光共聚焦显微镜照片证明，在特定665nm波长的LED灯光照(20mW/cm²)下，乳腺癌MDA-MB-231细胞内光敏剂BTM被激发诱导产生活性氧，通过绿色荧光探针2′，7′-二氯荧光素二乙酸盐染色细胞内活性氧；其中，A：光照边界的细胞明场照片；B光照边界的荧光照片；C：前两种成像的合并图；

图5为荧光共聚焦显微镜照片证明，在特定665nm波长的LED灯光照下，乳腺癌MDA-MB-231细胞内光敏剂BTM被激发诱导产生单线态氧，并杀伤细胞使细胞收缩且细胞核受损；其中，A：光照前；B：光照后；C：光照前DAPI染色的细胞核；D：光照后DAPI染色的细胞核，图中标尺为20μm；

图6为透射电镜照片证明，公告号为CN103755753A中国发明专利中的糖基化氟硼二吡咯衍生物不能与乳化剂Tween80共组装形成粒径均匀的纳米胶束；

图7为荧光共聚焦显微镜照片证明，中国发明专利CN103755753A中的糖基化氟硼二吡咯衍生物制备的纳米胶束，与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养后，内吞进入乳腺癌细胞量较少，而且LED光照(665nm，20mW/cm²)后并未发现明显细胞受损；其中，A：光照后DAPI染色的细胞核；B：光照后光敏剂荧光成像照片；

图8为本发明制得的BTM的化学结构式；

图9为本发明制得的BTM1的化学结构式；

图10为本发明制得的BTM2的化学结构式。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

缩写：DMSO，二甲基甲酰胺；DCM，二氯甲烷；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；BTN，叠氮基取代的BODIPY光敏剂；BTMn，糖基化氟硼二吡咯衍生物，n表示编号；D-甘露糖修饰BODIPY光敏剂；TweenX，乳化剂吐温，X表示吐温系列号；SpanX，乳化剂司盘，X表示司盘序列号。

实施例1

将 (86mg，394.12μmol)和

(100mg，78.67μmol)用DMSO溶解，于氩气氛围下鼓泡10min，称取抗坏血酸(8.7mg，43.92μmol)和CuSO₄·5H₂O(6.5mg，26.09μmol)用去离子水(DMSO:H₂O＝15:1，v/v，8mL)溶解并鼓泡5分钟。再将上述水溶液加入反应体系中，于25℃下反应48小时。终止反应，过滤除去不溶物，向滤液中加入适量的乙二胺四乙酸二钠的饱和水溶液，充分混匀后，移入透析袋(MW1000)中透析3天，每6小时换水。最后将澄清的绿色溶液冻干，经过高效液相色谱纯化得到纯品BTM，化学结构式如图7所示。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝1.47(s,6H),3.36–3.63(m,30H),3.66–3.79(m,10H),3.84(m,5H),4.15(m,6H),4.46–4.59(m,14H),4.67(dd,J＝12.2,2.9,3H),4.73(m,7H),7.07(d,J＝7.3,4H),7.16(d,J＝8.3,2H),7.34(d,J＝8.3,2H),7.44(d,J＝5.3,2H),7.58(d,J＝8.4,4H),8.10(m,5H).ESI-MS:m/z calcd for C₇₈H₁₀₀BF₂I₂N₁₁O₂₇:1925.49；found:1949.31[M+Na]⁺。

实施例2

将 (86mg，394.12μmol)和

(100mg，78.67μmol)用DMSO溶解，于氩气氛围下鼓泡10min，称取抗坏血酸(8.7mg，43.92μmol)和CuSO₄·5H₂O(6.5mg，26.09μmol)用去离子水(DMSO:H₂O＝15:1，v/v，8mL)溶解并鼓泡5分钟。再将上述水溶液加入反应体系中，于25℃下反应48小时。终止反应，过滤除去不溶物，向滤液中加入适量的乙二胺四乙酸二钠的饱和水溶液，充分混匀后，移入透析袋(MW 1000)中透析3天，每6小时换水。最后将澄清的绿色溶液冻干，经过高效液相色谱纯化得到纯品BTM1，化学结构式如图8所示。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ＝1.47(s,6H),3.36–3.63(m,30H),3.65–3.79(m,10H),3.84(m,5H),4.15(m,6H),4.45–4.59(m,14H),4.67(dd,J＝12.2,2.9,3H),4.73(m,7H),7.07(d,J＝7.3,4H),7.16(d,J＝8.3,2H),7.34(d,J＝8.3,2H),7.44(d,J＝5.3,2H),7.58(d,J＝8.4,4H),8.10(m,5H).ESI-MS:m/z calcd for C₇₈H₁₀₀BF₂I₂N₁₁O₂₇:1925.49；found:1949.20[M+Na]⁺。

实施例3

将 (154mg，405.46μmol)和

(100mg，78.67μmol)用DMSO溶解，于氩气氛围下鼓泡10分钟，称取抗坏血酸(8.7mg，43.92μmol)和CuSO₄·5H₂O(6.5mg，26.09μmol)用去离子水(DMSO:H₂O＝15:1，v/v，8mL)溶解并鼓泡5分钟。再将上述水溶液加入反应体系中，于25℃下反应48小时。终止反应，过滤除去不溶物，减压蒸馏除去滤液中的DMSO。最后将澄清的绿色溶液冻干，获得纯品BTM2。化学结构式如图9所示.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)1.50(s,6H),3.35–3.80(m,62H),3.92(m,5H),4.10–4.59(m,38H),6.97(d,J＝8.8,4H),7.06(d,J＝8.6,2H),7.16(d,J＝8.6,2H),7.59(m,6H),8.12(m,5H).MALDI-TOF MS:m/z calcd for C₉₆H₁₃₀BF₂I₂N₁₁O₄₂:2412.72；found:2435.36[M+Na]⁺。

实施例4

与实施例1相似，将甘露糖换成半乳糖。

实施例5

与实施例1相似，将甘露糖换成果糖。

实施例6

与实施例3相似，将麦芽糖换成乳糖。

实施例7

与实施例3相似，将麦芽糖换成壳寡糖。

实施例8：BTM@Tween 80胶束的制备

称取1mg BTM固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制0.1％吐温80水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3天，每6小时换水。图1为BTM@Tween 80胶束的透射电镜照片。

实施例9：BTM1@Tween 80胶束的制备

称取1mg BTM1固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制0.01％吐温80水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3天，每6小时换水。

实施例10：BTM2@Tween 80胶束的制备

称取1mg BTM2固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制1％吐温80水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3天，每6小时换水。

实施例11：BTM@Tween 20胶束的制备

与上述制备方法类似。称取1mg BTM固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制0.1％吐温20水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3d，每6小时换一次水。采用透析冻干法制得BTM胶束粉末。

实施例12：BTM@Tween 60胶束的制备

同上述BTM@Tween 80的制备方法一样。称取1mg BTM固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制0.1％吐温60水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3d，每6小时换一次水。采用透析冻干法制得BTM胶束粉末。

实施例13：BTM@Tween X胶束的制备

同上述BTM@Tween 80的制备方法一样。称取1mg BTM固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制0.1％吐温X(吐温其它系列)水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3d，每6小时换一次水。采用透析冻干法制得BTM胶束粉末。

实施例14：BTM1@Tween X胶束的制备

同上述BTM1@Tween 80的制备方法一样。称取1mg BTM固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制0.01％吐温X(吐温其它系列)水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3d，每6小时换一次水。采用透析冻干法制得BTM胶束粉末。

实施例15：BTM2@Tween X胶束的制备

同上述BTM2@Tween 80的制备方法一样。称取1mg BTM固体粉末，用1mL DMF溶解配制成1mg/mL母液待用；另配制1％吐温X(吐温其它系列)水溶液(体积比)。将上述两种溶液按体积比3/7配置成混合溶液，搅拌30min，充分混合后静止片刻，再将其转移至透析袋(MW 15000)中透析3d，每6小时换一次水。采用透析冻干法制得BTM胶束粉末。

实施例16：BTM@SpanX胶束的制备

同上述BTM@Tween 80的制备方法一样。唯一的不同之处在于乳化剂为Span 80、Span 60或Span 20。

实施例17：BTM@Tween 80胶束的TEM表征

对制得的BTM@Tween 80胶束的粒径、流体力学粒径分布及长期稳定性进行表征。BTM胶束的真实粒径通过透析电子显微镜(TEM)直接观察，从图1的TEM照片可以看出，纳米胶束成圆形，平均粒径为29nm，并且分散性良好。

实施例18：负载光敏剂胶束细胞毒性的实验

将实施例8中所得到的负载光敏剂胶束分别加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用MTT方法测定细胞的相对存活率，具体实验方法可参考：Q.Zhang,Y.Cai,X.-J.Wang,et.al.ACS Applied Materials&Interfaces 2016,8,33405。图2为BTM@Tween 80胶束对两种细胞的毒性，胶束分别与人乳腺癌MDA-MB-231细胞和正常乳腺MCF-10A细胞共同孵育24小时，细胞存活率高于90％。

类似地，验证了其它实施例中制备的本发明的纳米胶束，结果显示，细胞的存活率较高，显示这些纳米胶束的毒性非常小或没有毒性。

实施例19：负载光敏剂细胞光毒性的实验

将实施例8中所得到的负载光敏剂胶束分别加入到培养液中进行细胞培养实验。培养24小时后，利用665nm LED灯(20mW/cm²)光照细胞30分钟。然后用MTT方法测定细胞的相对存活率。可以看出，纳米胶束对乳腺癌MDA-MB-231细胞的光毒性明显高于正常乳腺MCF-10A细胞。

类似地，验证了其它实施例中制备的本发明的纳米胶束，结果显示，它们均具有上述性能。

实施例20：荧光标记法证明BTM@Tween80胶束被乳腺癌细胞内吞进入溶酶体的实验

将实施例8中所得到的负载光敏剂胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用细胞溶酶体染色试剂盒染细胞的溶酶体。由于光敏剂BTM成红色荧光，溶酶体染色试剂成绿色荧光，所以通过用激光共聚焦显微镜观察红色荧光和绿色荧光的重合程度，激发波长为488/561nm。图3为纳米胶束进入细胞溶酶体的共聚焦照片，可以看出，纳米胶束被癌细胞内吞进入溶酶体。

类似地，验证了其它实施例中制备的本发明的纳米胶束，结果显示，它们均可以被乳腺癌细胞内吞进入溶酶体。

实施例21：荧光标记法证明被乳腺癌细胞内吞的纳米胶束光照产生活性氧的实验

将实施例8中所得到的负载光敏剂胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，培养24小时后，利用665nm LED灯(20mW/cm²)光照细胞30分钟。然后用活性氧检测试剂盒(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐，DCFH-DA)染细胞内活性氧为绿色荧光，通过激光共聚焦显微镜观察细胞内绿色荧光，激发波长为488nm。图4为乳腺癌MDA-MB-231细胞内活性氧检测的共聚焦照片，可以看出，内吞进入癌细胞的光敏剂经过光照后产生大量活性氧。

类似地，验证了其它实施例中制备的本发明的纳米胶束，结果显示，它们均可以产生细胞内活性氧。

实施例22：荧光标记法证明光照光敏剂产生活性氧导致乳腺癌细胞受损的实验

将实施例8中所得到的负载光敏剂胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，培养24小时后，利用665nm LED灯(20mW/cm²)光照细胞30分钟。然后用共聚焦显微镜观察乳腺癌MDA-MB-231细胞形貌的变化。图5A为光照前的癌细胞形态照片，图5B为光照后癌细胞形态照片。另外，将细胞用甲醛固定，然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核成蓝色荧光。利用共聚焦显微镜观察光照前后细胞核受损情况，激发波长为405nm。图5C和5D为癌细胞核在特定665nm波长的LED灯(20mW/cm²)光照前后的共聚焦照片，可以看出，经过光照癌细胞的细胞核明显受损。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

糖基化氟硼二吡咯衍生物、表面糖修饰的纳米胶束及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。