专利摘要

本发明公开了共轭骨架聚合物及其应用和选择性失活碱性蛋白质的方法。该聚合物具有如式(I)所示的结构，式(I)所示聚合物中可以选择性地失活碱性蛋白质，可以有效地抑制心脏毒素的毒性。

权利要求

1.一种共轭骨架聚合物，该聚合物含有如式(I)所示的结构单元，

其中，R1具有如式(II)所示的结构，

R2具有如式(III)所示的结构，

聚合度n为10-200的整数，k为4-20的整数，q为1-5的整数，m为2-12的整数，*表示R1、R2在式(I)中键连的位置。

2.根据权利要求1所述的聚合物，其中，聚合度n为10-50的整数，k为6-12的整数，q为1-5的整数，m为2-8的整数。

3.根据权利要求1或2所述的聚合物，其中，聚合度n为16-19的整数，k＝8，q＝1，且m＝4。

4.一种选择性失活碱性蛋白质的方法，该方法包括：

(1)将含有碱性蛋白质的样品与权利要求1-3中任意一项所述的聚合物混合得到混合物；

(2)将步骤(1)所得混合物暴露于光下进行碱性蛋白质的失活。

5.根据权利要求4所述方法，其中，所述碱性蛋白质选自心脏毒素、LPO、Pap、α-CT、Cytc或Lys中的一种或多种。

6.根据权利要求4或5所述方法，其中，所述样品中还含有酸性蛋白质，优选地，所述酸性蛋白质选自HRP、BOD、GOD、BSA或G6PD中的一种或多种。

7.根据权利要求4或5所述方法，其中，所述碱性蛋白质与权利要求1所述聚合物的用量摩尔比为1：(1-20)，优选为1：(3-12)。

8.根据权利要求4或5所述方法，其中，步骤(2)中，所述光的波长为400-800nm。

9.根据权利要求4或5所述方法，其中，步骤(2)中，所述曝光的条件包括：温度为25-40℃，时间为5-30min。

10.权利要求1-3中任意一项所述的聚合物在抑制心脏毒素毒性中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及共轭骨架聚合物及其应用和选择性失活碱性蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质、多糖、核酸等生物大分子作为复杂的分子机器在生命活动中扮演重要的角色。很多生物大分子如蛋白质本身结构具有可以识别的“信号”，现有技术也常用这种可以识别的信号构建化合物或聚合物，以使其选择性地与特定的生物大分子结合，这种通过与天然的生物大分子结合(或组装)来操纵生物大分子的活性，在识知生命过程、疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。

目前，用响应性的聚合物和生物大分子构建智能的生物杂化材料引起越来越多的关注。例如设计含有磷酸基团侧链的聚合物，利用其和蛋白质表面的赖氨酸或精氨酸的多价静电作用来识别碱性蛋白质或多肽，或者利用主客体化学，葫芦脲和胰岛素蛋白质的氮端苯丙氨酸的超分子相互作用，构建与蛋白质的组装体。此外，还有设计合成的聚合物纳米粒子，根据蛋白质表面的疏水性的差异，选择性识别蛋白质聚集体并帮助其重新折叠为可溶性蛋白质。

但是上述化合物或聚合物与蛋白质结合或组装都是依靠非共价键作用，如静电作用、分子间力、氢键等，非共价键作用容易受外界环境如温度、pH等影响，使得形成的结合或组装不稳定。此外，现有技术的依靠非共价键作用结合的化合物或聚合物可以和多种蛋白质结合，不具有选择性和特异性，因此，亟需一种可以与蛋白质稳定结合的化合物或聚合物，能够确保结合的稳定性和选择性，从而实现对蛋白质的活性进行调控。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的与蛋白质结合不稳定、结合没有选择性等问题，提供了共轭骨架聚合物及其应用和选择性失活碱性蛋白质的方法。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种共轭骨架聚合物，该聚合物含有如式(I)所示的结构单元，

其中，R1具有如式(II)所示的结构，

R2具有如式(III)所示的结构，

其中，聚合度n为10-200的整数，k为4-20的整数，q为1-5的整数，m为2-12的整数，*表示R1、R2在式(I)中键连的位置。

本发明第二方面提供了一种选择性失活碱性蛋白质的方法，该方法包括：

(1)向含有碱性蛋白质的样品中加入本发明第一方面所述的聚合物得到混合物，

(2)将步骤(1)所得混合物暴露于光下。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述聚合物在抑制心脏毒素毒性中的应用。

本发明的发明人发现式(I)所示聚合物中可以选择性地与碱性蛋白质结合并反应。同时式(I)所示聚合物在光照条件下可以敏化氧气分子产生活性氧，所述活性氧可以破坏蛋白质的结构，抑制蛋白质的活性。并且由于所产生的活性氧寿命较短，只能和聚合物邻近的蛋白质发生作用，从而实现选择性地光照失活与式(I)所示聚合物结合的碱性蛋白质。

而自然界中大部分生物毒素蛋白质都是碱性的，它们一般通过破坏细胞膜或细胞骨架，影响离子通道功能进而引起细胞凋亡。而本发明提供的式(I)所示聚合物可以与这些毒素蛋白质结合并反应，进而可以通过光照选择性地失活这些毒素蛋白质，抑制这些毒素蛋白质的活性。

更特别地，心脏毒素是一种来自中华眼镜蛇的毒素蛋白，表面静电势计算结果显示其表面分布有高密度的正电荷。式(I)所示聚合物可以有效地抑制心脏毒素引起的溶血效应，并极大提高了注射心脏毒素后小鼠的生存率。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是聚合物1(PPV-NHS)的合成路线图；

图2是PPV-NHS与不同蛋白质作用后，PPV-NHS的ζ电位变化和水合粒径变化；

图3是PPV-NHS与不同蛋白质作用后的凝胶电泳图；

图4是DCFH被PPV-NHS产生的活性氧氧化后的荧光强度随时间的变化图；

图5是HRP、LPO分别与PPV-NHS混合前后，置于暗处和白光照射下，HRP和LPO的活性变化；

图6是CTX、CTX加入PPV-NHS前后(分别置于暗处和白光照射下)，对红细胞溶血作用随时间变化曲线；

图7是PPV-NHS对注射CTX后的小鼠的解毒实验结果。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

聚合物及其制备方法

本发明第一方面提供了一种共轭骨架的聚合物，该聚合物含有如式(I)所示的结构单元，

其中，R1具有如式(II)所示的结构，

R2具有如式(III)所示的结构，

聚合度n为10-200的整数，k为4-20的整数，q为1-5的整数，m为2-12的整数，*表示R1、R2在式(I)中键连的位置。

在一种实施方式中，聚合度n为10-50的整数，k为6-12的整数，q为1-5的整数，m为2-8的整数。

在一种实施方式中，优选地，聚合度n为16-19的整数，k＝8，q＝1，且m＝4，即所述聚合物具有如式(IV)所示结构，称作聚合物1(即PPV-NHS)：

根据本发明，式(I)所示聚合物可以按照下式(V)所示流程来制备，根据式(V)所示流程，化合物6与化合物7经取代反应得到化合物8，化合物8和化合物10缩聚反应得到聚合物11。式(V)所示流程中涉及的各反应的反应条件可以根据现有技术来选择，例如化合物8和化合物10缩聚反应这一步骤，可以在催化剂醋酸钯、催化剂配体P(o-Tol)3和三正丁胺存在下，溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中进行。具体地，聚合物1可以按照附图1所示流程来制备。

式(V)中，化合物7中的Ts-表示4-甲基苯磺酸酯基，NHS表示N-羟基丁二酰亚胺，EDCI表示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐。

如式(V)所示，通过选择不同的原料化合物7(k的不同取值)，不同的原料化合物9(m的不同取值)，不同的原料化合物12(q的不同取值)，以及化合物8和化合物10缩聚反应的限定(不同的聚合度n)，得到不同的式(I)所示聚合物。

聚合物选择性失活碱性蛋白质

碱性蛋白质，即生理条件下带正电荷的蛋白质，例如α-糜蛋白酶(α蛋CT)，木瓜蛋白酶(Pap)，乳过氧化物酶(LPO)，细胞色素c(Cyt c)，溶菌酶(Lys)；而酸性蛋白质，即生理条件下带负电荷、等电点(pI)小于7.4的蛋白质，包括辣根过氧化物酶(HRP)、胆红素氧化酶(BOD)，葡萄糖氧化酶(GOD)，牛血清白蛋白(BSA)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)。通过对式(I)所述聚合物例如聚合物1(PPV-NHS)进行Zeta(ζ)电位测试得知PPV-NHS表面带负电荷，ζ电位为-21.1±0.07mV。从图2可以看出，当将PPV-NHS分别与酸性蛋白质BSA、GOD和HRP混合后，PPV-NHS的ζ电位几乎不发生变化；而当将PPV-NHS分别与碱性蛋白质Pap、α-CT和Cyt c混合后，PPV-NHS的ζ电位发生明显的正向移动，说明PPV-NHS与碱性Pap、α-CT、Cyt c发生了选择性结合。同时动态光散射数据结果也证明了这一点。具体地，通过动态光散射测得PPV-NHS的水合粒径为240nm。当分别加入酸性蛋白质BSA、GOD和HRP后，如图2所示，PPV-NHS的粒径几乎不发生变化；而当分别加入碱性蛋白质Pap、α-CT、Cyt c后，如图2所示，PPV-NHS的粒径明显增大。

而变性凝胶电泳测试结果说明了PPV-NHS与碱性蛋白质的反应(即共价结合)。将酸性蛋白质(HRP、BOD、GOD、BSA、G6PD)与碱性蛋白质(LPO、α-CT、Pap、Cyt c、Lys)(蛋白质浓度为20μmol/L)分别与不同浓度的PPV-NHS(20μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L)在pH＝7.4的PBS溶液中37℃温度下作用30min，之后进行凝胶电泳测试。并设置单独的蛋白质作为空白对照组。高分子量蛋白质HRP、BOD、GOD、BSA、G6PD、和LPO，使用含12％分离胶和5％浓缩胶的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；分子量较低的蛋白质α-CT、Pap、Cyt c和Lys，使用含有16.5％分离胶、10％夹层胶和4％浓缩胶的三甲基甘氨酸-十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质条带使用考马斯亮蓝染色。所得变性凝胶电泳图如图3所示，从图3可以看出，PPV-NHS与酸性蛋白质作用后蛋白质条带与空白对照组相比几乎没有变化，说明PPV-NHS不与酸性蛋白质反应。而当PPV-NHS与碱性蛋白混合后，在碱性蛋白质与式(I)所示聚合物的摩尔比例为1：(1-20)的范围内，随着PPV-NHS浓度的增加，原有蛋白质条带逐渐消失，在高分子量区出现新的条带，说明PPV-NHS和碱性蛋白质发生了共价反应使整体的分子量增加。

在本发明中，式(I)所示聚合物可以选择性地与碱性蛋白质共价结合(共价反应)，并且可以在光照下产生活性氧物种。本发明的发明人使用活性氧物种探针2,7-二氯荧光素-3,6-二乙酯(DCFH-DA)验证了式(I)所述聚合物例如PPV-NHS产生活性氧的能力。在碱性条件下DCFH-DA水解为2,7-二氯荧光素-3,6-二乙酸(DCFH)，DCFH可以在活性氧存在的条件下被氧化为高荧光的2,7-二氯荧光素，其在488nm激发后在525nm处有强的发射。图4为将PPV-NHS加入新鲜制备的DCFH溶液(DCFH的浓度为40μmol/L，PPV-NHS的浓度为10μmol/L)后的525nm处荧光强度(激发波长为488nm)随光照时间(白光密度为5mW·cm-2)的变化图。随着时间的延长，525nm处的荧光明显高于对照组(不加PPV-NHS)，说明PPV-NHS具有优异的产生活性氧的能力。

活性氧可以破坏蛋白质的结构，使蛋白质失活，并且活性氧寿命短，一般只能使毗邻的蛋白质失活。本发明人发现式(I)所示聚合物可以选择性地使碱性蛋白质失活，而不影响其他蛋白质如酸性蛋白质的活性。

在本发明中，所述“失活”应理解为将蛋白质的活性降低至原蛋白质活性的0-30％。

本发明的发明人使用两种带有相反表面电荷的过氧化物酶研究了式(I)所示聚合物如PPV-NHS对不同蛋白质活性的影响。将式(I)所示聚合物如PPV-NHS与不同的蛋白质在暗处下混合，并分别在光照和暗处下处理(例如持续10min)，然后分别检测其活性，同时设置单独的蛋白质作为空白对照组(空白对照组用于说明单纯的光照对蛋白质活性影响不大)。从图5可以看出，与PPV-NHS混合之后，无论在光照条件还是暗处条件，酸性蛋白质HRP的活性都几乎不发生变化，说明式(I)所示聚合物如PPV-NHS不影响HRP的活性；而碱性蛋白质如LPO，在暗处作用后，活性降低至原蛋白质活性的60％，白光照射后，活性进一步降至20％。因此，式(I)所示聚合物如PPV-NHS可以选择性地失活碱性蛋白质。

基于此，本发明第二方面提供了一种选择性失活碱性蛋白质的方法，该方法包括：

(1)将含有碱性蛋白质的样品与本发明第一方面所述聚合物混合得到混合物；

(2)将步骤(1)所得混合物暴露于光下进行选择性失活。

在本发明所述选择性失活碱性蛋白质的方法中，所述样品可以为含有碱性蛋白质的任何样品。在一种实施方式中，所述样品还可以含有酸性蛋白质，所述酸性蛋白质选自HRP、BOD、GOD、BSA、G6PD以及其他酸性蛋白质中的一种或多种。

在本发明所述选择性失活碱性蛋白质的方法中，所述碱性蛋白质可以为本领域常见的碱性蛋白质，优选地所述碱性蛋白质选自心脏毒素、LPO、Pap、α-CT、Cyt c、Lys中的一种或多种。

在本发明所述选择性失活碱性蛋白质的方法中，步骤(1)中，所述碱性蛋白质与本发明第一方面所述聚合物的用量摩尔比为1：(1-20)，优选为1：(3-12)，更优选为1：(5-10)。在一种实施方式中，步骤(1)中，所述混合在生理条件下进行，并保持20-40min。在另一种实施例方式中，步骤(1)中，所述混合在pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中进行，并保持20-40min。

在本发明所述选择性失活碱性蛋白质的方法中，步骤(1)中，所述混合的温度为20-40℃。

在本发明所述选择性失活碱性蛋白质的方法中，步骤(2)中，所述光的波长为400-800nm，光学密度为50-150mW·cm-2。

在本发明所述选择性失活碱性蛋白质的方法中，步骤(2)中，所述曝光的条件包括：温度为25-40℃，时间为5-30min。

聚合物在抑制心脏毒素毒性中的应用

由于自然界中大部分生物毒素蛋白都是碱性蛋白质，它们一般通过破坏细胞膜或者细胞骨架影响离子通道的功能进而引起细胞凋亡。而式(I)所示聚合物可以使碱性蛋白质失活，因此也可以用于抑制这些毒素蛋白的活性。心脏毒素(CTX)是一种来自中华眼镜蛇的毒素蛋白，表面静电势计算结果显示其表面分布有高密度的正电荷，可以有效地和式(I)所示聚合物结合并反应，进一步被光照失活，从而抑制该毒素对红细胞的破环，避免溶血。

基于此，本发明第三方面提供了式(I)所示聚合物在抑制心脏毒素毒性中的应用。

发明人使用小鼠和人的红细胞研究了单独的CTX与加入PPV-NHS后的溶血作用。具体地，将新鲜的血液收集在含有肝素的样品管中，用10mmol/L PBS洗两次，1500转离心10分钟，然后将红细胞稀释到2％。在CTX(10μmol/L)和红细胞的混合液中加入PPV-NHS(50μmol/L)(并设置不加PPV-NHS的作为对照组)分别在80mW·cm-2的白光下照射10min，继续在37℃培养8h，每一个小时取样品离心，测上清液576nm处血红蛋白的吸收。设置暗处作用10min(对应于光照10min)为对照实验，只加10mmol/L PBS作为阴性对照，只加1％triton-X 100作为阳性对照。从图6可以看出，随着孵育时间的延长，CTX表现出明显的溶血作用，在8h后溶血率达到约15％(小鼠)和33％(人)。加入PPV-NHS可以将溶血率降至5％以下，光照后，CTX引起的溶血效果进一步被抑制，并且单独的PPV-NHS对红细胞没有破坏性。

发明人还通过模拟动物被毒蛇咬伤解毒的小鼠实验证实了式(I)所示聚合物如PPV-NHS对CTX的解毒效果。如图7示出了单独注射CTX(25μmol/L，200μL)、单独注射PPV-NHS(125μmol/L，200μL)以及注射CTX(25mol/L，200μL)间隔3min后继续注射PPV-NHS(125μmol/L,200μL)的小鼠的生存情况。注射CTX之后，小鼠在18分钟内全部死亡，而在注射CTX间隔3min后注射PPV-NHS持续观察两天，有57％的小鼠存活；尽管有43％的小鼠死亡，但其生存时间明显延长到了50min左右。因此，PPV-NHS可以明显延长小鼠生存时间，提高小鼠的生存率，对CTX具有良好的解毒效果。

因此，本申请所述式(I)所示聚合物如PPV-NHS可以有效地抑制CTX的毒性，对CTX具有良好的解毒效果。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

实施例1用于说明聚合物1即PPV-NHS的制备。

参照附图1中的工艺流程制备PPV-NHS。

(1)制备化合物3

在10mL丙酮中加入K2CO3(0.23g)，通入N2以除去溶剂中的O2。在N2保护下加入化合物2,5-二碘-1,4-苯二酚(化合物1，0.2g)，23-羟基-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂二十三烷4-甲基苯磺酸酯(化合物2，0.59g)，将反应温度升至60℃，在N2气氛下反应30h。冷却至室温后，过滤洗涤沉淀。得到滤液用无水Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂。粗产物用硅胶柱层析分离纯化，得淡黄色液体(0.13g，22％)。将所得淡黄色液体进行核磁氢谱测试、核磁碳谱测试和质谱测试，所得数据如下：

1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.37(s,1H),4.55(t,J＝4.0Hz,1H),4.09(t,J＝6.0Hz,2H),3.74(t,J＝4.0Hz,2H),3.62(m,2H),3.50(m,24H),3.42(m,2H)；

13C-NMR(100MHz,CDCl3,δ):153.01,123.36,87.35,72.79,70.61,70.32,70.23,70.17,69.41,60.66；

HR-MS(MALDI):[M+K]+＝1105.2127，找到1105.2132的峰。

由以上数据可知，所得淡黄色液体即为化合物3。

(2)制备化合物5

将13,13'-((2,5-二碘-1,4-亚苯基)双氧基)双(2,5,8,11-四氧杂十三烷)(化合物4，0.5g)溶解在12mL甲苯中，通入N2以除去溶剂中的O2，在N2保护下向该溶液中加入三丁基乙烯基锡(1.27g)和乙醇洗涤过的Pd(PPh3)4(16mg)，升温至100℃反应16h。停止加热待反应液冷却至室温后，用40mL 2mol/L KF水溶液除去未反应的三丁基乙烯基锡。收集有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂。粗产物用硅胶柱层析分离纯化，得无色油状液体(0.21g，59％)。将所得无色油状液体进行核磁氢谱测试、核磁碳谱测试和质谱测试，所得数据如下：

1H-NMR(300MHz,CDCl3,δ):7.07-6.98(m,4H),5.74(dd,J＝16.5,1.2Hz,2H),5.26(dd,J＝9.9,1.2Hz,2H),4.13(t,J＝4.8Hz,4H),3.85(t,J＝5.4Hz,4H),3.75-3.63(m,20H),3.53(m,4H),3.37(s,6H)；

13C-NMR(100MHz,CDCl3,δ):151.00,131.68,127.91,114.61,111.54,72.24,71.16,70.98,70.95,70.93,70.82,70.18,69.40,59.30；

HR-MS(MALDI):[M+K]+＝581.2723，找到581.2728的峰。

由以上数据可知，所得无色油状液体即为化合物5。

(3)制备PPV-OH

在N2保护下将化合物3(0.21g)，化合物5(0.11g)，催化剂醋酸钯(10mg)，催化剂配体P(o-Tol)3(20mg)和三正丁胺(0.50mmol)溶解在5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，通N2以除去溶剂中氧气，反应液升温至100℃，在氮气保护下反应48h。停止加热待反应液冷却至室温后，用甲醇透析，透析袋截留分子量为7500，最后将甲醇旋蒸除去，得到深红色油状液体(0.18g，56％)。将所得深红色油状液体进行核磁氢谱测试和凝胶色谱测试，所得数据如下：

1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):7.52(br,2H),7.25(br,2H),4.53(br,1H),4.21-3.39(br,48H),3.19(s,3H)；

GPC:MW＝29020,PDI＝1.15，聚合度n为16-19。

核磁氢谱数据显示所得深红色油状液体即为PPV-OH。

(4)制备PPV-COOH

在4mL聚合物PPV-OH(15mg)的超干二氯甲烷溶液中，冰浴条件下加入丁二酸酐(20mg)，冰浴搅拌1h后继续将反应温度升至室温搅拌24h。用二氯甲烷稀释，并用饱和食盐水洗。收集有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，除去溶剂，得到橙色油状液体(7.5mg,44％)。将所得橙色油状液体进行核磁氢谱测试，所得数据如下：

1H-NMR(300MHz,CDCl3-d6,δ):7.43(br,2H),7.17(br,2H),4.23-4.12(br,5H),3.93(br,4H),3.75-3.50(br,36H),3.34(s,3H),2.62(s,4H)。

核磁氢谱数据显示，所得橙色油状液体即为PPV-COOH。

(5)制备PPV-NHS

将PPV-COOH(20mg)溶于4mL超干二氯甲烷(DCM)中，在0℃下加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(4.5mg)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDCI，6.32mg)。在0℃下继续反应1h后移至室温继续反应24h。加入10mL二氯甲烷稀释，并用水洗，用无水Na2SO4干燥后，浓缩，得到橙红色油状液体(18mg,80％)。将所得橙红色油状液体进行核磁氢谱测试，所得数据如下：

1H-NMR(300MHz,CDCl3-d6,δ):7.42(br,2H),7.15(br,2H),4.25-4.12(br,5H),3.91(br,4H),3.73-3.49(br,36H),3.34(s,3H),2.93(t,2H),2.85(s,4H),2.75(t,2H)。

核磁氢谱数据显示，所得橙红色油状液体即为PPV-NHS。

对比例1-3、实施例2-4

对比例1-3、实施例2-4用于说明PPV-NHS可以选择性失活碱性蛋白。

对比例1

(1)将酸性蛋白质HRP与PPV-NHS在pH＝7.4的PBS溶液中37℃下混合，得到混合物，并保持30min，其中酸性蛋白质HRP的浓度为20μmol/L，PPV-NHS的浓度为200μmol/L；

(2)将步骤(1)所得混合物在白光(波长为400-800nm，光密度为80mW·cm-2)下37℃温度下暴露10min；

(3)检测蛋白质的活性，结果如图5所示。

对比例2

参照对比例1所述方法，不同的是，步骤(2)中，将所得混合物置于暗处而非光照，并检测蛋白质的活性，结果如图5所示。

实施例2

(1)将碱性蛋白质LPO与PPV-NHS在pH＝7.4的PBS溶液中37℃下混合，得到混合物，并保持30min，其中碱性蛋白质HRP的浓度为20μmol/L，PPV-NHS的浓度为200μmol/L；

(2)将步骤(1)所得混合物在白光(波长为400-800nm，光密度为80mW·cm-2)下37℃温度下暴露10min；

(3)检测蛋白质的活性，结果如图5所示。

从图5可知，与PPV-NHS作用后，HRP的活性几乎不变，而LPO的活性降低至原蛋白质活性的20％。因此PPV-NHS可以选择性失活碱性蛋白质，而几乎不影响酸性蛋白质的活性。

对比例3

参照实施例2所述方法，不同的是，步骤(2)中，将所得混合物置于暗处而非光照，并检测蛋白质的活性，结果如图5所示。

从图5可知，无论在光照条件还是暗处条件，酸性蛋白质HRP的活性都几乎不发生变化；碱性蛋白质LPO，在暗处作用后，活性降低至原蛋白质活性的60％。

实施例3

参照实施例2所述方法，不同的是，步骤(2)中，其中PPV-NHS的浓度为100μmol/L，其余与实施例2相同，检测蛋白质的活性，蛋白质的活性降低至原蛋白质活性的30％。

实施例4

参照实施例2所述方法，不同的是，步骤(2)中，其中PPV-NHS的浓度为140μmol/L，其余与实施例2相同，检测蛋白质的活性，蛋白质的活性降低至原蛋白质活性的25％。

实施例5

实施例5用于说明PPV-NHS对蛇毒蛋白心脏毒素的解毒作用。

(1)找21只质量、体征相同的小白鼠，7只注射单独的CTX(25μmol/L,200μL)，7只注射单独的PPV-NHS(125μmol/L,200μL)，7只注射CTX(25μmol/L,200μL)间隔3min后继续注射PPV-NHS(125μmol/L,200μL)；

(2)观察21只小鼠的生存情况，结果如图7所示。

从图7可知，单独注射PPV-NHS的7只小鼠生命体征良好；单独注射CTX的7只小鼠，在注射18分钟内全部死亡；而注射CTX间隔3min后继续注射PPV-NHS的小鼠，持续观察两天，有4只小鼠存活，存活率达到57％；尽管有43％的小鼠死亡，但其生存时间也延长到了50min左右。

综上，本发明式(I)所示的结构的聚合物，特别是PPV-NHS可以选择性地失活碱性蛋白质而不影响酸性蛋白质的活性，而且可以有效地抑制心脏毒素的毒性，具有良好的解毒效果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

共轭骨架聚合物及其应用和选择性失活碱性蛋白质的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。