专利摘要

本发明提供了一种生物智能的电响应性细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：将电活性无规共聚物溶解于醇类溶剂中，加入微载体及氧化剂，进行氧化聚合反应，干燥后得到生物智能的电响应性细胞微载体；所述电活性无规共聚物为含有苯胺四聚体和多巴胺官能团的电活性无规共聚物；所述氧化剂为高碘酸钠和/或高碘酸钾。本发明通过多巴胺邻苯二酚的氧化聚合直接将电活性的苯胺四聚体引入到微载体表面，同时还可将生物活性分子固定到微载体上，且制备得到的电响应性细胞微载体在有机溶剂中依然具有优异的结合力，稳定不脱落。本发明还提供了一种生物智能的电响应性细胞微载体及应用。

权利要求

1.一种生物智能的电响应性细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：

将电活性无规共聚物溶解于醇类溶剂中，加入微载体及氧化剂，进行氧化聚合反应，干燥后得到生物智能的电响应性细胞微载体；

所述电活性无规共聚物为含有苯胺四聚体和多巴胺官能团的电活性无规共聚物；

所述氧化剂为高碘酸钠和/或高碘酸钾；所述醇类溶剂为甲醇和/或乙醇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电活性无规共聚物与氧化剂的质量比为1：（0.1~10）。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电活性无规共聚物的质量与醇类溶剂的体积之比为（0.5~2.5）g：（1~10）mL；

所述微载体的质量与醇类溶剂体积之比为（0.05~5）g：（1~10）mL。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化聚合反应的温度为30~45℃；所述氧化聚合反应的时间为12~50小时；

所述氧化聚合反应在搅拌条件下进行，所述搅拌的速率为130~180rpm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物微载体、聚乳酸微载体、聚醚醚酮微载体和复合有羟基磷灰石的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述电活性无规共聚物按照以下步骤制备得到：

将聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、多巴胺甲基丙烯酰胺、苯胺四聚体甲基丙烯酰胺及引发剂在惰性气体环境中溶解于溶剂中，在20~30℃下搅拌0.4~0.6小时，然后移至油浴中60~85℃下反应20~50小时，得到电活性无规共聚物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述多巴胺甲基丙烯酰胺、苯胺四聚体甲基丙烯酰胺、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和引发剂的质量比为(15~40) ：(0.1~18)：(50~80)：(0.1~2)。

8.一种生物智能的电响应性细胞微载体，按照权利要求1~7任意一项所述的制备方法制得。

9.如权利要求8所述的生物智能的电响应性细胞微载体在制备骨组织损伤修复药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于细胞微载体的制备技术领域，尤其涉及一种生物智能的电响应性细胞微载体、其制备方法及应用。

背景技术

微载体是一种能在立体空间支持贴壁型细胞在其表面黏附、生长及代谢的球形颗粒。在动物细胞的大规模培养技术中，微载体培养法具有多种优势：其表面积/体积比率大，增加了细胞黏附生长的面积，减少了细胞培养所占的空间，有利于细胞的大规模培养和收集，单位体积培养液的细胞产率高；细胞收获过程相对简单，劳动强度小；细胞传代时避免了胰酶对细胞带来的损伤，只需要添加新的微载体即可；培养基利用率高以及放大容易等，是目前公认的最有发展前途的一种培养模式。微载体细胞培养技术可在动态立体培养环境下实现对细胞的快速大量高质量的扩增，以便于组织工程需要及干细胞治疗。

近年来，随着技术的进步，利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)等无毒、生物相容性好的可降解高分子材料制备的微载体。也可将聚醚醚酮(PEEK)为代表的特种高分子材料制备出不可降解的微载体。此外，结合有机合成高分子材料易加工成型及无机生物陶瓷(如羟基磷灰石(HA))的生物相容性的优点，可制备出复合成分微载体材料。自1970年ANIL B.MUKHERJEE等人发现骨组织存在压电性以来，材料的电活性成为研究人员关注的热点。如何将电活性材料引入到微载体表面成为研究难题。

目前用于微载体表面修饰电活性、生物活性等功能性材料有通过物理吸附和化学键结合两种方法。其中，作为一种常用的固定功能性基团的方法，物理吸附通常是非特异性而且效率不高。而通常的化学共价结合往往需要多步骤以及复杂的程序，比如需要通过预处理对材料表面进行活化，或者需要氧等离子、紫外等照射、或者添加其他化学物质。这种改性会明显改变材料的整体性质，甚至导致材料表面变性。因此，一种简单、可靠、高效的功能性材料固定方法对微载体表面进行改性将会有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物智能的电响应性细胞微载体、其制备方法及应用，本发明中的电响应性细胞微载体稳定性好，制备方法简单、高效。

本发明提供一种生物智能的电响应性细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：

将电活性无规共聚物溶解于醇类溶剂中，加入微载体及氧化剂，进行氧化聚合反应，干燥后得到生物智能的电响应性细胞微载体；

所述电活性无规共聚物为含有苯胺四聚体和多巴胺官能团的电活性无规共聚物；

所述氧化剂为高碘酸钠和/或高碘酸钾。

优选的，所述电活性无规共聚物与氧化剂的质量比为1：(0.1～10)。

优选的，所述电活性无规共聚物的质量与醇类溶剂的体积之比为(0.5～2.5)g：(1～10)mL；

所述微载体的质量与醇类溶剂体积之比为(0.05～5)g：(1～10)mL。

优选的，所述氧化聚合反应的温度为30～45℃；所述氧化聚合反应的时间为12～50小时；

所述氧化聚合反应在搅拌条件下进行，所述搅拌的速率为130～180rpm。

优选的，所述醇类溶剂为甲醇和/或乙醇。

优选的，所述微载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物微载体、聚乳酸微载体、聚醚醚酮微载体和复合有羟基磷灰石的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或几种。

优选的，所述电活性无规共聚物按照以下步骤制备得到：

将聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、多巴胺甲基丙烯酰胺、苯胺四聚体甲基丙烯酰胺及引发剂在惰性气体环境中溶解于溶剂中，在20～30℃下搅拌0.4～0.6小时，然后移至油浴中60～85℃下反应20～50小时，得到电活性无规共聚物。

优选的，所述多巴胺甲基丙烯酰胺、苯胺四聚体甲基丙烯酰胺、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和引发剂的质量比为(15～40)：(0.1～18)：(50～80)：(0.1～2)。

一种生物智能的电响应性细胞微载体，按照上文所述的制备方法制得。

如上文所述的生物智能的电响应细胞微载体在骨组织损伤修复中的应用。

本发明提供了一种生物智能的电响应性细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：将电活性无规共聚物溶解于醇类溶剂中、加入微载体及氧化剂，进行氧化聚合反应，干燥后得到生物智能的电响应性细胞微载体；所述电活性无规共聚物为含有苯胺四聚体和多巴胺官能团的电活性无规共聚物；所述氧化剂为高碘酸钠和/或高碘酸钾。本发明将含有苯胺四聚体及多巴胺官能团的电活性无规共聚物在高碘酸钠氧化剂环境中，通过多巴胺邻苯二酚的氧化聚合直接将电活性的苯胺四聚体引入到微载体表面，同时还可将生物活性分子固定到微载体上，制备出生物活性电活性的微载体，且制备得到的电响应性细胞微载体在有机溶剂中依然具有优异的结合力，稳定不脱落。此方法简单方便，可适用于多种微载体表面，适用范围广泛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中的PAT电活性无规共聚物的循环伏安曲线；

图2为本发明实施例1中PLGA微载体的体视显微镜图片；

图3为本发明实施例1中PAT@PLGA微载体的体视显微镜图片；

图4为本发明实施例1中PAT@PLGA微载体的红外光谱图；

图5为本发明实施例2中PEEK微载体的体视显微镜图片；

图6为本发明实施例2中PAT@PEEK微载体的体视显微镜图片；

图7为本发实施例2中PAT@PEEK微载体的红外光谱图；

图8为本发明实施例3中PLGA/HA微载体的体视显微镜图片；

图9为本发明实施例3中PAT@PLGA/HA微载体的体视显微镜图片；

图10为本发明实施例3中PAT@PLGA/HA微载体的X射线光电子能谱图(XPS)；

图11为本发明实施例3中PAT@PLGA/HA微载体的红外光谱图(FT-IR)；

图12为本发明实施例3中电活性PAT@PLGA/HA微载体表面的SEM图；

图13为本发明实施例3中电活性PAT@PLGA/HA微载体切面的SEM图；

图14为本发明比较例1中微载体产物的红外光谱图；

图15为本发明比较例1中微载体产物的XPS谱图；

图16为本发明比较例2中微载体产物的红外光谱图；

图17为本发明比较例3中微载体产物的红外光谱图；

图18为本发明实施例3中的PAT@PLGA/HA在1,3,7天MC3T3-E1前成骨细胞增殖情况；

图19为本发明实施例3中的PAT@PLGA/HA在7，14天的碱性磷酸酶(ALP)活性；

图20为本发明实施例3中的PAT@PLGA/HA在14,21天茜素红钙定量结果。

具体实施方式

本发明提供了一种生物智能的电响应性细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：

将电活性无规共聚物溶解于醇类溶剂中，加入微载体及氧化剂，进行氧化聚合反应，干燥后得到生物智能的电响应性细胞微载体；

所述电活性无规共聚物为含有苯胺四聚体和多巴胺官能团的电活性无规共聚物；

所述氧化剂为高碘酸钠和/或高碘酸钾。

在本发明中，所述电活性无规共聚物为含有苯胺四聚体和多巴胺官能团的电活性无规共聚物(PAT)，优选按照以下步骤制备得到：

将聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、多巴胺甲基丙烯酰胺、苯胺四聚体甲基丙烯酰胺及引发剂在惰性气体环境中与溶剂混合，在20～30℃下搅拌0.4～0.6小时，然后移至油浴中60～85℃下反应20～50小时，得到电活性无规共聚物。

优选的，氮气环境中，将聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、多巴胺甲基丙烯酰胺、苯胺四聚体甲基丙烯酰胺及偶氮二异丁腈(AIBN)加入到Schlenk瓶中，接着注射干燥及除氧后的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂，氮气环境中室温搅拌半小时，移至油浴中60-85℃反应20-50h。反应结束后，冷却至室温加入少许甲醇终止反应，随后加入二氯甲烷稀释溶液，在乙醚中沉降2-5次，干燥后得电活性无规共聚物。

具体反应过程如下：

具体的，本发明中所使用的电活性无规共聚物可参照申请号为201811509073.8的中国专利中所公开的制备方法通过自由基聚合进行制备，其所公开的所有技术内容均被引用至本申请中。

在本发明中，所述微载体优选为聚乳酸-羟基乙酸共聚物微载体(PLGA)、聚乳酸微载体、聚醚醚酮微载体(PEEK)和复合有羟基磷灰石的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA/HA)中的一种或几种。

PLGA微载体

本发明优选使用高压静电法制备PLGA微载体，将PLGA溶于有机溶剂N-甲基吡咯烷酮中，置于设置有针头的推注装置中，利用高压静电场使PLGA溶液带电，在针头末端形成液滴，形成的液滴滴入萃取溶剂中(60％乙醇)，针头距液面的距离为7.5cm。通过溶剂萃取原理快速去除液滴中的NMP溶剂，以此制备PLGA微载体。再用筛网过滤，得到的PLGA微球。在本发明中，所述PLGA微球的直径优选为200～500μm，更优选为300～400μm，具体的，在本发明的实施例中，可以是307±15μm。

PEEK微载体

本发明优选通过气流法制备PEEK微载体，将PEEK粉溶于浓硫酸中，室温机械搅拌2h，静置十分钟后，将混合液体加入到50mL的针筒中；沉降液为30％乙醇(1000mL)，冰浴，针头距离上述沉降液液面高度为14cm，采用气流法制备PEEK微球，气流流速为6～7L/min，泵压为0.26～0.28MPa。通过溶剂萃取置换得到PEEK微球后，再用筛网过滤，得到PEEK微球。在本发明中，所述PEEK微球的直径优选为200～500μm，更优选为300～400μm，具体的，在本发明的实施例中，可以是343±27μm。

PLGA/HA微载体

本发明通过高压静电法制备PLGA/HA微载体。将HA分散于NMP中，超声30min，将PLGA溶于上述溶液中，把混合溶液设置有针头的推注装置中，沉降液为60％乙醇溶液，针头距离上述沉降液液面高度为6cm，利用高压静电场使PLGA/HA溶液在针头末端形成液滴，形成的液滴滴入沉降液中，通过溶剂萃取原理快速去除液滴中的NMP溶剂，以此快速制备PLGA/HA微载体。再用筛网过滤，得到球形度良好、尺寸均一的PLGA/HA微球。在本发明中，所述PLGA/HA微球的直径优选为150～400μm，更优选为200～350μm，具体的，在本发明的实施例中，可以是281±16μm。

本发明使用醇类作为微载体与电活性无规共聚物的氧化聚合溶剂，所述醇类溶剂能够溶解无规共聚物及与氧化剂溶液互溶。在本发明中，所述醇类溶剂优选为甲醇和/或乙醇。

在本发明中，所述氧化剂优选为高碘酸钠和/或高碘酸钾。

在本发明中，所述电活性无规共聚物与氧化剂的质量比优选为1：(0.1～10)，更优选为1：(0.5～8)，最优选为1：(1～5)，具体的，在本发明您的实施例中，可以是1：1；所述电活性无规共聚物的质量与醇类溶剂的体积之比优选为(0.5～2.5)g：(1～10)mL，更优选为(1～2)g：(2～8)mL，最优选为(1～2)g：(3～5)mL，具体的，在本发明的实施例中，可以是1g:5mL；所述微载体的质量与醇类溶剂的体积之比优选为(0.05～5)g：(1～10)mL，更优选为(0.1～4)g：(2～8)mL，最优选为(1～3)g：(3～5)mL，具体的，在本发明的实施例中，可以是1g:5mL。

在本发明中，所述氧化聚合反应的温度优选为30～45℃，更优选为35～40℃，最优选为37℃；所述氧化聚合反应的时间优选为12～50小时，更优选为15～45小时，最优选为20～40小时。本发明优选在搅拌的条件下进行上述氧化聚合反应，所述搅拌的速率优选为130～180rpm，更优选为140～170rpm，最优选为150～160rpm。

反应完成之后，本发明优选使用去离子水和乙醇分别洗涤2～5次，然后冷冻干燥得到球形度良好、尺寸均一的电响应性细胞微载体。

本发明还提供了一种生物智能的电响应性细胞微载体，按照上文所述的制备方法制得。本发明中的电响应性细胞微载体为球形，其直径优选为200～600μm，更优选为300～400μm。

本发明还提供了一种生物智能的电响应细胞微载体在骨组织损伤修复中的应用。本发明所制备出的电响应性的微载体，通过多巴胺的邻苯二酚基团将细胞因子或其它活性蛋白固定于微载体表面。本方法获得的生物活性电活性细胞微载体不仅可用于生物反应器体外大规模细胞培养，还可将细胞/微载体培养物直接应用于体内，进行组织修复治疗。导电性聚合物可修饰于多种类型微载体表面，比如将PAT修饰到PLGA微载体表面可制备生物降解性的电活性微载体；将PAT修饰到PEEK微载体表面可制备不可降解的电活性微载体；将PAT修饰到PLGA/HA微载体表面可制备出电活性的有机无机复合材料微载体。此方法简单易行，适用于大规模工业化生产。PAT表面修饰不仅提高微载体表面的电活性和细胞亲和性，还提高了对细胞因子等活性蛋白药物的结合能力和担载量；制备的微载体具有一定的功能，能够促进细胞生长增殖和诱导细胞分化，适合于各种细胞的体外大规模培养和体内治疗的输送载体。

本发明将导电高分子材料通过多巴胺的氧化反应引入到微载体表面，使微载体具有电活性，同时可固定生长因子，方法简单高效。避免了化学共价结合的复杂过程，及其可能导致的微载体表面变性。电活性微载体有利于MC3T3-E1成骨细胞等组织细胞的增殖及分化，生长因子的固定能进一步提高细胞增殖分化能力，在治疗骨组织损伤等方面具有广泛的应用前景。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种生物智能的电响应性细胞微载体、其制备方法及应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将0.5g PLGA溶于5mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，置于设置有针头的推注装置中，利用高压静电场使PLGA溶液带电，在针头末端形成液滴，形成的液滴滴入萃取溶剂中(60％乙醇)，针头距液面的距离为7.5cm。通过溶剂萃取原理快速去除液滴中的NMP溶剂，以此制备PLGA微载体。再用筛网过滤，得到直径为307±15μm的PLGA微球。

按照专利201811509073.8中的制备方法制备得到电活性无规共聚物PAT。

将PAT溶于乙醇溶剂中(0.6g PAT：3ml溶剂)，加入PLGA微载体(0.6g)和高碘酸钠水溶液(0.6g氧化剂：3ml去离子水)，37℃、160rpm搅拌24h，去离子水、乙醇或甲醇分别洗涤5次，后冷冻干燥或真空干燥得到电活性可降解PAT@PLGA微载体，其直径为309±22μm。

对制备得到的PAT无规共聚物进行电活性测试，用CHI660A电化学分析仪测试循环伏安曲线，扫描速率为100mV/s，对电极为铂片，参比电极为饱和甘汞电极，工作电极为玻碳电极，测试前需要除氧处理。结果如图1所示，图1为本发明实施例1中的PAT电活性无规共聚物的循环伏安曲线，由图1聚合物的循环伏安曲线可知，PAT聚合物的三对氧化峰分别出现在0.27V，0.45V及0.88V处。由此可以得出聚合具有良好的氧化还原性。

图2为本发明实施例1中PLGA微载体的体视显微镜图片，图3为本发明实施例1中PAT@PLGA微载体的体视显微镜图片。有图2～3可以看出，制备得到的PAT@PLGA微载体为球形，且尺寸较为均一。

图4为本发明实施例1中PAT@PLGA微载体的红外光谱图，由PAT@PLGA微载体的红外谱图中可以看出，1510处出现苯环上C-C振动吸收峰，说明成功将PAT修饰到PLGA微载体上。

实施例2

将1.8g PEEK粉溶于30mL浓硫酸中，室温机械搅拌2h，静置十分钟后，将混合液体加入到50mL的针筒中；沉降液为30％乙醇(1000mL)，冰浴，针头距离上述沉降液液面高度为14cm，采用气流法制备PEEK微球，气流流速为6～7L/min，泵压为0.26～0.28MPa。通过溶剂萃取置换得到PEEK微球后，再用筛网过滤，得到直径为343±27μm的PEEK微球。

按照专利201811509073.8中的制备方法制备得到电活性无规共聚物PAT。

将PAT溶于乙醇或甲醇溶剂中(0.6g PAT：3ml溶剂)，加入PEEK微载体(0.6g)和高碘酸钠水溶液(0.6g氧化剂：3ml去离子水)，37℃、160rpm搅拌24h，去离子水、乙醇分别洗涤2～5次，后冷冻干燥得到电活性不可降解PAT@PEEK微载体，直径为399±30μm。

图5为本发明实施例2中PEEK微载体的体视显微镜图片，图6为本发明实施例2中PAT@PEEK微载体的体视显微镜图片。有图5～6可以看出，本实施例中的PAT@PEEK微载体为球形，且尺寸均一。

图7为本发实施例2中PAT@PEEk微载体的红外光谱图，由PAT@PEEK微载体的红外谱图中可以看出，2875及1730处分别出现PAT中端甲基及酯羰基峰，说明成功将PAT修饰到PEEK微载体上。

实施例3

将0.125g HA分散于5mL NMP中，超声30min，将0.5g PLGA溶于上述溶液中，把混合溶液设置有针头的推注装置中，沉降液为60％乙醇溶液，针头距离上述沉降液液面高度为6cm，利用高压静电场使PLGA/HA溶液在针头末端形成液滴，形成的液滴滴入沉降液中，通过溶剂萃取原理快速去除液滴中的NMP溶剂，以此快速制备PLGA/HA微载体。再用筛网过滤，得到球形度良好、尺寸均一的直径为281±16μm的PLGA/HA微球。

按照专利201811509073.8中的制备方法制备得到电活性无规共聚物PAT。

将PAT溶于乙醇或甲醇溶剂中(0.6g PAT：3ml溶剂)，加入PLGA/HA微载体(0.6g)和高碘酸钠水溶液(0.6g氧化剂：3ml去离子水)，37℃、160rpm搅拌24h，去离子水、乙醇分别洗涤5次，后冷冻干燥得到球形度良好、尺寸均一的电活性复合材料PAT@PLGA/HA微载体。直径为329±16μm。

图8为本发明实施例3中PLGA/HA微载体的体视显微镜图片，图9为本发明实施例3中PAT@PLGA/HA微载体的体视显微镜图片，由图8～9可以看出，制备得到的PAT@PLGA/HA微载体球形度良好、尺寸均一。

图10为本发明实施例3中PAT@PLGA/HA微载体的X射线光电子能谱图(XPS)；图11为本发明实施例3中PAT@PLGA/HA微载体的红外光谱图(FT-IR)。由XPS图可以看出，PAT@PLGA/HA微载体上检测到氮元素的特征峰。FT-IR中发现，在2875及1660处出现甲基及苯羰基峰，说明成功将PAT修饰到PLGA/HA微载体上。

图12为本发明实施例3中电活性PAT@PLGA/HA微载体表面的SEM图，图13为本发明实施例3中电活性PAT@PLGA/HA微载体切面的SEM图。其中，m代表PLGA/HA，n代表PAT@PLGA/HA。从图中可以看出，PLGA/HA微载体表面有空洞的存在，但是PAT@PLGA/HA微载体表面空洞消失。两种微载体切面都出现明显的蜂窝巢结构。

比较例1

将PAT溶于乙醇或甲醇溶剂中(0.6g PAT：3ml溶剂)，加入实施例1制备的PLGA微载体(0.6g)，37℃、160rpm搅拌24h，去离子水、乙醇或甲醇清洗2～5次后，冷冻干燥或真空干燥得到的微载体。

图14为本发明比较例1中微载体产物的红外光谱图，图15为本发明比较例1中微载体产物的XPS谱图，由图14～15可以看出，在其红外谱图中，没有发现PAT的特征峰。此外，在XPS谱图中，产物PAT@PLGA中没有出现氮元素的特征峰，说明比较例1中的方法无法将电活性PAT引入到PLGA微载体上。

比较例2

将PAT溶于乙醇或甲醇溶剂中(0.6g PAT：3ml溶剂)，加入实施例1制备的PLGA微载体(0.6g)及过氧化氢水溶液(3ml过氧化氢：3ml去离子水)，37℃、160rpm搅拌24h，去离子水、乙醇或甲醇分别洗涤2～5次，冷冻干燥或真空干燥得到的微载体，经红外光谱及XPS光谱分析，无法将电活性PAT引入到PLGA微载体上。

图16为本发明比较例2中微载体产物的红外光谱图，由图16可以看出，在其红外谱图中，没有发现PAT的特征峰。说明比较例2中的方法无法将电活性PAT引入到PLGA微载体上。

比较例3

将PAT溶于丙酮或二氯甲烷或三氯甲烷溶剂中(0.6g PAT：1ml～10ml溶剂)，加入实施例1制备的PLGA微载体(0.6g)和高碘酸钠(或高碘酸钾)水溶液(0.6g氧化剂：3ml去离子水)，37℃、160rpm搅拌24h，去离子水、乙醇或甲醇分别洗涤2～5次，经红外光谱及XPS光谱分析，无法将电活性PAT引入到PLGA微载体上。

图17为本发明比较例3中微载体产物的红外光谱图，由图17可以看出，在其红外谱图中，没有发现PAT的特征峰。说明比较例3中的方法无法将电活性PAT引入到PLGA微载体上。

经比较例1～3方法制备出的PAT@PLGA产物，在其红外谱图中，没有发现PAT的特征峰。此外，在XPS谱图中，产物PAT@PLGA中没有出现氮元素的特征峰。以上结果说明经过经对比例1～3的方法无法将电活性PAT引入到微载体上。

应用实施例

将生长因子DOPA-IGF-1固定到实施例3中的PLGA/HA及PAT@PLGA/HA微载体上，进行生物学表征，具体固定方法如下：

首先，将实验室所制备的冻干的蛋白粉配成浓度为50ng/mL的YKYKY-IGF-1溶液，加入1/3体积的维生素C溶液(5mg/mL)，加入1/3体积的酪氨酸羟化酶(500μg/mL)，调节体系pH＝7.2，室温静置2h。接着，将所得DOPA-IGF-1溶液用无菌滤头过滤到灭菌后的微载体上，调节pH＝8.5，室温静置过夜。然后，将DOPA-IGF-1溶液吸弃，用无菌PBS清洗材料表面三次，种植MC3T3-E1细胞并进行增殖分化实验。

图18为本发明实施例3中的PAT@PLGA/HA在1,3,7天MC3T3-E1前成骨细胞增殖情况，图18为本发明实施例3中的PAT@PLGA/HA在7，14天的碱性磷酸酶(ALP)活性，图20为本发明实施例3中的PAT@PLGA/HA在14,21天茜素红钙定量结果。由图18～20结果可以看出，与对照组PLGA/HA微载体相比，电活性微载体能一定程度的促进细胞成骨增殖及分化，在微载体担载生长因子DOPA-IGF-1后，细胞的成骨增殖及分化能力进一步提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

一种生物智能的电响应性细胞微载体、其制备方法及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。