专利摘要

本发明公开一种用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法，属于有机化合物的生物合成技术领域。本发明以来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶为催化剂，程序升温下催化水解从单一甜菊苷或甜叶菊提取物中的甜菊苷来制备甜菊醇，具有转化率高、选择性高、分离简单等优点；通过程序升温反应来降低酶活损失，可提高酶的利用率。本发明提供了一种高效、环境友好的制备甜菊醇的新方法。

说明书

技术领域

发明属于有机化合物的生物合成技术领域，具体涉及一种用来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的β-葡萄糖苷酶程序升温催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法。

背景技术

       甜菊苷(13-[(2-O-β-D-Glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]kaur-16-en-18 -oic acid β-D-glucopyranosyl ester，stevioside，以下简称St)是从甜叶菊 (Stevia rebaudiana Bertoni)中提取出的四环二萜类化合物，是一种具有后苦涩味的甜味剂。St分子中含有三种糖苷键，经水解可以得到甜菊醇、异甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、悬钩子苷或者其混合物；水解产物的各组分含量取决于水解条件：例如用无机碱催化水解St得到甜菊双糖苷 (Sharipova R, et al, 2009)，用无机酸催化水解St则得到甜菊醇和异甜菊醇的混合物 (专利号：200910025817.3)。例如张大永等通过化学法两步制备甜菊醇，首先St经高碘酸钠或四醋酸铅氧化，然后经碱水解、柱层析纯化后得到甜菊醇 (专利号：200810242967.5)。Avent等指出酸性水解St除得到甜菊醇和异甜菊醇以外，还有其他两种同分异构体 (Avent A G, et al, 1990)。用同种酶催化水解St也可能得到不同产物。因而如果通过利用酶的高区域选择性酶催化方法水解St，可以一步直接获得高品质单一水解产物，同时还可以通过改变水解反应条件调控产品组成，Milagre等指出在pH 4.0下，胰酶 (Pancreatin)催化St水解反应的产物为异甜菊醇；而在pH 7.0下，产物为甜菊醇 (Milagre H M S, et al, 2009)。

酶催化虽然优点众多，但热稳定性差成为酶使用过程中不可回避的问题。通常可以通过外加稳定剂，固定化等途径来提高热稳定性。来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶在75 ^oC下会较快失活，但同时又在70-75 ^oC下具有最高催化水解效率。因此本发明采用程序升温反应的方式可以有效减少酶的热失活并兼顾水解反应速度，而且避免固定化酶与析出的产物混为一体，减少纯化的困难，提高来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的稳定性并有效缩短完成水解反应的时间。

发明内容

本发明的目的是提供一种用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法。本发明用筛选出的来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，水解St制备得到甜菊醇；通过程序升温反应，降低酶的热失活。生产过程绿色环保，催化效率高，产品分离纯化简单，纯度高。

来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶催化甜菊苷制备甜菊醇的反应方程式如下：

本发明的目的可以通过如下的技术方案达到：以甜菊苷St或者含有St的甜菊叶提取物 (同时含有莱鲍迪苷 A (RA)、莱鲍迪苷 C (RC))等为底物，将底物用去离子水或缓冲液配制成150-300 g/L的反应液；55 ^oC下恒温0.5 h后加入来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，同温下反应2-6 h，反应时间随加酶量而定，优选加酶量为800 U/g St时反应3 h (酶活测定所用底物为4-硝基苯酚-β-D-葡萄吡喃糖苷 pNPG)；然后升温至70-75 ^oC下反应至甜菊苷转化率不再升高；甜菊苷水解成甜菊醇从反应液中析出，而其他甜叶菊提取物的成分没有或很少反应；对反应液进行抽滤，用水洗涤滤渣后用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇白色产品。所说的缓冲液为pH 4.0-5.4的醋酸缓冲液或者pH 6.0的磷酸缓冲液。

所说的β-葡萄糖苷酶来源于黑曲霉 (购于韩国biobean生物科技有限公司)，其形态是酶液。

所说的反应温度为程序升温的温度，即先在55 ^oC下反应2-6 h，然后在70-75 ^oC下反应至St转化率不再升高。

所说的缓冲液为50 mM的pH 4.0-5.4的醋酸缓冲液或pH 6.0磷酸缓冲液。

所述β-葡萄糖苷酶催的添加量为为500-1000U/g 甜菊苷。

本发明的有益效果：本专利提供了一种制备甜菊醇的新方法，拓展了甜菊苷的用途，大大提升其附加值。来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶为食品工业用酶制剂，安全、高效、选择性高。与其他方法不同的是，产物中没有异甜菊醇；而且其他甜菊苷衍生物不参加水解。采用程序升温反应的方式可以有效减少酶的热失活并兼顾水解反应速度，从而提高酶的利用率。反应条件温和、产率高、产物分离纯化简单。

附图说明

图1  本发明中产物甜菊醇的HPLC (a)和总离子流图 (b)。

图2  本发明中产物甜菊醇的一级质谱 (a)和二级质谱 (b)。

图3  本发明中产物甜菊醇的¹³CNMR。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

将15 g St (市售品，纯度为97%) 分散在55 ^oC的100 mL去离子水中，放入55 ^oC水浴摇床中震摇0.5 h，摇床转速为150 rpm；加入β-葡萄糖苷酶酶液800 U/g St；反应至St转化率不再上升。St转化率为99.0%。冷却反应液后抽滤，并分别用母液和去离子水洗涤滤饼，再用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇产品。最终产物的HPLC纯度大于98 %。反应共需8小时。

对产品进行LC-MSMS和NMR分析，结果见附图1-3。LC-MSMS中主成份的分子离子峰 (317.4，[M-H]^-)可以对应甜菊醇，水解产物的NMR也可进一步证实产物为甜菊醇。

St转化率可参照国标 (GB8270-1999)通过HPLC外标法测定 (式1)。

      X_t：t时刻St的转化率；

      C₀：初始St的浓度 (g/L)；

      C_t：t时刻St的浓度 (g/L)；

实施例2

将20 g 90% St (甜菊提取物，含10% RA)溶解在55 ^oC的100 mL去离子水中，放入55 ^oC水浴摇床中震摇0.5 h，摇床转速为150 rpm；加入β-葡萄糖苷酶酶液600 U/g St；反应3 h后升至75 ^oC继续反应至St转化率不再上升。再用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇产品。反应共需3.5小时。

实施例3

将15 g St分散在50 mM的100 mL pH 5.0的醋酸缓冲液中，放入55 ^oC水浴摇床中震摇0.5 h，摇床转速为150 rpm；加入β-葡萄糖苷酶酶液700 U/g St；反应3h后升至70 ^oC继续反应至St转化率不再上升。反应共需4小时。再用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇产品。

实施例4

将30 g St粗品 (50% St，40% RA，5% RC及其它)溶解在100 mL去离子水中，放入55 ^oC水浴摇床中震摇0.5 h，摇床转速为150 rpm；加入β-葡萄糖苷酶500 U/g St；反应5 h后，升温至70 ^oC下反应1 h，通过HPLC分析发现St全部转化为甜菊醇，RA和RC转化率均<5%。再用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇产品。

实施例5

将30 g St粗品 (St 90%)溶解在200 mL去离子水中，放入水浴摇床中震摇并在55 ^oC下恒温0.5 h，摇床转速为150 rpm；加入β-葡萄糖苷酶500 U/g St；反应5 h后，升温至75 ^oC下反应5 h，通过HPLC分析发现St全部转化为甜菊醇，RA和RC转化率均<5%。再用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇产品。

实施例6

将20 g St溶解在100 mL醋酸缓冲液 (pH 4.6，50 mM)中，放入55 ^oC水浴摇床中震摇0.5 h，摇床转速为150 rpm；加入β-葡萄糖苷酶酶液900 U/g St；反应6 h后升至75 ^oC继续反应至St转化率不再上升。再用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇产品。

实施例7

将20 g St溶解在100 mL磷酸缓冲液 (pH 6.0，50 mM)中，放入水浴摇床中震摇并在55 ^oC下恒温0.5 h，摇床转速为150 rpm；加入β-葡萄糖苷酶酶液1000 U/g St；反应6 h后升至75 ^oC继续反应至St转化率不再上升。再用20%甲醇水溶液重结晶即可得到甜菊醇产品。

用β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。