专利摘要

本发明涉及一株能将去氢表雄酮有效转化为1α-羟基去氢表雄酮的菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086及其培养方法与转化甾体药物中的应用，属于微生物技术领域。该菌株在2010年8月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC 4075。本发明所述的菌株具有生长迅速，易于培养的特点，该菌株可高效的将去氢表雄酮转化为1α-羟基去氢表雄酮，并且产物易于提取，终产物纯度高。经检测，1α-羟基去氢表雄酮的生物转化率为20～50％，产物提取得率75～80％，1α-羟基去氢表雄酮产品纯度大于99.5％。

说明书

技术领域

本发明涉及一株能将去氢表雄酮有效转化为1α-羟基去氢表雄酮的菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086及其培养方法与在转化甾体药物方面中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

甾体药物具有抗感染、抗病毒和抗肿瘤等作用，被广泛用于治疗皮肤病、风湿病、心血管病、癌症等，已成为人类药物中消费量仅次于抗生素的药物。甾体药物结构十分复杂，含有多个不对称中心，尤其是它的活性高低主要取决于取代基，而且往往是特定位点的取代基，如C1α、C11β位上的羟基以及C1、C2位的双键等。目前利用全合成的方法生产甾体药物比较困难，通常以具有甾体母核结构的天然产物为原料采用半合成的方法修饰后制得。

去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是一种具有甾体母核结构的C19类固醇化合物(结构式如下)

化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式为C₁₉H₂₈O₂，它是合成许多甾体药物的重要中间体。例如，在母核的A环上进行羟基化修饰的得到的1α-羟基去氢表雄酮(结构式如下)

是合成骨化三醇(结构式如下)

等活性维生素D3类药物的重要中间体；又如，先令公司应用亚麻刺盘孢菌(Colletotrichum lini)的羟化酶系统直接转化法和间接转化方法对去氢表雄酮生物转化，得到了7α，15α-二羟基去氢表雄酮(结构式如下)

以7α，15α-二羟基去氢表雄酮为前体合成口服避孕药屈螺酮，屈螺酮已经在美国和欧洲上市。

目前在甾体药物的生产中，微生物转化是甾体药物修饰的重要手段，甾体每个位置几乎都能进行生物转化，比较重要的微生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链降解等。甾体药物的羟基化菌株在文献中曾经有过一些报道，如黑根霉(Rhizops nigricans)，新月弯孢霉(CurvμLaria lunata)，蓝色犁头霉(Absidia coerμLea)，玫瑰产色链霉菌(Strtomyces roseochromomogenus)，S球墨孢霉(Nigraspora spherical)等等，但这些菌株对甾体药物的羟基化类型主要是11β-OH、16α-OH、19-OH。化学合成法应用于甾体化合物羟基化最大的局限性在于它的选择性较差，尤其是在甾体母核的C1α位引入甾体活性所必须的氧原子极其困难。目前能够有效在甾环C1位进行α-羟基化转化的微生物较少，如果能够筛选到具备甾环C1位α-羟基化能力的微生物菌株，并利用优选的生物转化工艺通过微生物的单加氧酶体系在甾环C1位置引入α-羟基，则可通过微生物转化一步反应代替化学修饰所需的多步反应，这将对许多种维生素D3类药物的生产起到非常关键的作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种能将去氢表雄酮有效转化为1α-羟基去氢表雄酮的菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086，并提供利用该菌株将去氢表雄酮有效转化为1α-羟基去氢表雄酮的方法。

本发明的技术方案如下：

一株菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086，该菌株在2010年8月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC 4075。

菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086菌株能将去氢表雄酮有效转化为1α-羟基去氢表雄酮，该菌株由斜卧青霉Penicillium decumbens ph-13菌株经紫外线和化学方法累积诱变后筛选得到。紫外诱变条件：4mL浓度为10⁵个/mL的孢子悬液，20W的紫外灯，垂直照射距离30cm，照射30min。化学诱变条件：在6ml浓度为10⁵个/mL的孢子悬液中添加1ml终浓度为0.5％(V/V)硫酸二乙酯诱变剂，诱变10min，添加4％(m/V)的硫代硫酸钠0.5ml终止诱变。物理化学诱变交替进行，多轮次累积诱变后，通过生物转化能力比较，筛选出1α-羟基去氢表雄酮转化得率最高的突变菌株，命名为斜卧青霉Penicillium decumbens UC086。该菌株在马铃薯琼脂(PDA)平板培养基上生长，菌落圆形，扩展，最初2天菌丝体为白色生长密集。菌落表面平坦，孢子呈粉状覆盖在菌落表面，整个菌落与培养基结合很紧密，菌落背面呈暗黄色。显微镜下观察菌丝体透明，分枝多且有横隔，顶端的分生孢子梗不对称分布，分生孢子梗呈扫帚状，分生孢子呈圆形或椭圆形，表面光滑呈灰绿色(如图1所示)。

上述菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086的培养方法，步骤如下：

(1)取菌种保藏号为CGMCC 4075的斜卧青霉UC086接种于活化培养基，培养条件：温度27～29℃，培养3～4天，得活化后的斜卧青霉UC086；

(2)取活化后的斜卧青霉UC086接种于种子培养基中，于25～35℃、100～300r/min的培养条件下培养2～4天，过滤，即得。

所述步骤(1)中的活化培养基组分如下：马铃薯(去皮)：200g，葡萄糖：20g，琼脂：20g，水：1000mL，pH值自然。

所述步骤(2)中的种子培养基组分如下：碳源1～5g/L，氮源1～5g/L，无机盐0.01～2g/L，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉之一；氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、硝酸钠、硫酸铵之一；无机盐选自硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰之一；pH 5.0～9.0。

上述种子培养基组分如下：葡萄糖3～5g/L，酵母浸粉3-5g/L，硫酸镁为0.1～1g/L。

所述步骤(2)中种子培养基的接种量为5×10⁶～1×10⁸个/mL。

上述菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086在利用去氢表雄酮生产1α-羟基去氢表雄酮方面的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)取经培养后的斜卧青霉UC086，接入生物转化培养基，培养1～2天，然后向生物转化培养基中添加底物溶液，使培养基中去氢表雄酮终浓度达到0.2～2g/L，25～35℃、100～300r/min培养3～5天，得诱导培养液；

(2)将步骤(1)制得的诱导培养液与有机溶剂混合萃取30～60min，将萃取物加入柱层析硅胶进行吸附，干法上样，柱层析分离，收集组分进行TLC(薄层层析)检测，目标组分浓缩，再进行1～3次柱层析分离，目标组分浓缩即得1α-羟基去氢表雄酮。1α-羟基去氢表雄酮为白色针状结晶。

所述步骤(1)中的生物转化培养基中，碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖、柠檬酸之一，添加量为1～5g/L；氮源选自蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、硝酸钠之一，添加量为1～5g/L；无机盐选自硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰之一，添加量为0.0001～2g/L，pH 5.0～9.0。

上述生物转化培养基组分如下：蔗糖为3～5g/L，硝酸钠为3～5g/L，硫酸镁为0.1～1g/L，硫酸锰为0.0001～0.01g/L，硫酸亚铁为0.0001～0.01g/L。

所述步骤(1)中的底物溶液通过如下步骤配制：

用溶剂溶解去氢表雄酮，按每克去氢表雄酮溶解于10～20毫升溶剂计；优选的溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、环糊精之一。

所述步骤(2)中的机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮。

所述步骤(2)中的柱层析分离采用200～300目硅胶H进行柱层析分离。

所述步骤(2)的柱层析分离中的洗脱剂由乙酸乙酯和乙醚按体积比15～25∶1配制而成。

本发明有益效果如下：

本发明所述的菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086与野生菌株比较具有生长迅速，易于培养的特点，该菌株可高效的将去氢表雄酮转化为1α-羟基去氢表雄酮，并且产物易于提取，终产物纯度高。经检测，1α-羟基去氢表雄酮的生物转化率为20～50％，比野生菌株的转化率有大幅度提高，产物提取得率75～80％，1α-羟基去氢表雄酮产品纯度大于99.5％。

附图说明

图1是斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086的菌落和孢子形态照片；

图2是实施例1制得的1α-羟基去氢表雄酮的¹H-NMR核磁共振谱图；

图3是实施例1制得的1α-羟基去氢表雄酮的¹³C-NMR核磁共振谱图；

图4是实施例1制得的1α-羟基去氢表雄酮的HMBC核磁共振谱图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086，该菌株在2010年8月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC4075。

实施例中所用原料均可市场购得，实施例中所用核磁共振仪为Bruker Avance600型核磁共振波谱仪。

实施例1

菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086的培养方法，步骤如下：

(1)取菌种CGMCC4075的斜卧青霉UC086接种于活化培养基，培养条件：温度27℃，培养4天，得活化后的斜卧青霉UC086；

(2)取活化后的斜卧青霉UC086接种于种子培养基中，使种子培养基中的菌体浓度达到5×10⁶个/mL，于25℃、100r/min的培养条件下培养2天，过滤，即得。

所述步骤(1)中的活化培养基组分如下：马铃薯(去皮)：200g，葡萄糖：20g，琼脂：20g，水：1000mL，pH值自然。

种子培养基配方为葡萄糖3g/L，酵母浸粉3g/L，硫酸镁0.1g/L，pH 5.0。

菌株斜卧青霉UC086在利用去氢表雄酮生产1α-羟基去氢表雄酮方面的应用，步骤如下：

(1)取经培养后的斜卧青霉UC086，接入生物转化培养基，培养1天，然后向生物转化培养基中添加底物溶液，使培养基中去氢表雄酮终浓度达到0.2g/L，25℃、100r/min培养3天，得诱导培养液；

(2)将步骤(1)制得的诱导培养液与二氯甲烷混合萃取30min，将萃取物加入柱层析硅胶进行吸附，干法上样，200目硅胶H进行柱层析分离，洗脱剂由乙酸乙酯和乙醚按体积比15∶1配制而成，收集组分进行TLC检测，目标组分浓缩，再进行2次柱层析分离，目标组分浓缩即得1α-羟基去氢表雄酮。1α-羟基去氢表雄酮为白色针状结晶。经Bruker Avance600型核磁共振波谱仪检测，溶剂为CDCl₃，结果如图2-图4所示。

上述生物转化培养基组分如下：蔗糖为3g/L，硝酸钠为3g/L，硫酸镁为0.1g/L，硫酸锰为0.0001g/L，硫酸亚铁为0.0001g/L。

所述的底物溶液通过如下步骤配制：

用乙醇溶解去氢表雄酮，按每克去氢表雄酮溶解于10毫升乙醇计。直接将称量好的底物去氢表雄酮加入一定量的溶剂中震荡或搅拌溶解。

经检测，生物转化率22.3％，产物提取得率75.6％，1α-羟基去氢表雄酮产品纯度为99.6％。

实施例2

菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086的培养方法，步骤如下：

(1)取菌种保藏号为CGMCC 4075的斜卧青霉UC086接种于活化培养基，培养条件：温度29℃，培养3天，得活化后的斜卧青霉UC086；

(2)取活化后的斜卧青霉UC086接种于种子培养基中，使种子培养基中的菌体浓度达到5×10⁷个/mL，于30℃、150r/min的培养条件下培养3天，过滤，即得。

所述步骤(1)中的活化培养基组分如下：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然。

种子培养基配方为葡萄糖4.5g/L，酵母浸粉3.5g/L，硫酸镁1.2g/L，pH 7.0。

菌株斜卧青霉UC086在利用去氢表雄酮生产1α-羟基去氢表雄酮方面的应用，步骤如下：

(1)取经培养后的斜卧青霉UC086，接入生物转化培养基，培养2天，然后向生物转化培养基中添加底物溶液，使培养基中去氢表雄酮终浓度达到0.6g/L，30℃、150r/min培养4天，得诱导培养液；

(2)将步骤(1)制得的诱导培养液与二氯甲烷混合萃取45min，将萃取物加入柱层析硅胶进行吸附，干法上样，300目硅胶H进行柱层析分离，洗脱剂由乙酸乙酯和乙醚按体积比20∶1配制而成，收集组分进行TLC检测，目标组分浓缩，再进行2次柱层析分离，目标组分浓缩即得1α-羟基去氢表雄酮。1α-羟基去氢表雄酮为白色针状结晶。经BrukerAvance600型核磁共振波谱仪检测，结果如图2-图4所示。

上述生物转化培养基组分如下：蔗糖为4.75g/L，硝酸钠为3.69g/L，硫酸镁为0.31g/L，硫酸锰为0.001g/L，硫酸亚铁为0.001g/L。

所述的底物溶液通过如下步骤配制：

用丙酮溶解去氢表雄酮，按每克去氢表雄酮溶解于15毫升丙酮计。直接将称量好的底物去氢表雄酮加入一定量的溶剂中震荡或搅拌溶解。

经检测，生物转化率41.7％，产物提取得率79.9％，1α-羟基去氢表雄酮产品纯度为99.8％。

实施例3

菌株斜卧青霉(Penicillium decumbens)UC086的培养方法，步骤如下：

(1)取菌种保藏号为CGMCC 4075的斜卧青霉UC086接种于活化培养基，培养条件温度28℃，培养3天，得活化后的斜卧青霉UC086；

(2)取活化后的斜卧青霉UC086接种于种子培养基中，使种子培养基中的菌体浓度达到1×10⁸个/mL，于35℃、300r/min的培养条件下培养4天，过滤，即得。

所述步骤(1)中的活化培养基组分如下：马铃薯(去皮)：200g，葡萄糖：20g，琼脂：20g，水：1000mL，pH值自然。

种子培养基配方为葡萄糖5g/L，酵母浸粉5g/L，硫酸镁2g/L，pH 9.0

菌株斜卧青霉UC086在利用去氢表雄酮生产1α-羟基去氢表雄酮方面的应用，步骤如下：

(1)取经培养后的斜卧青霉UC086，接入生物转化培养基，培养2天，然后向生物转化培养基中添加底物溶液，使培养基中去氢表雄酮终浓度达到1g/L，350℃、300r/min培养5天，得诱导培养液；

(2)将步骤(1)制得的诱导培养液与二氯甲烷混合萃取60min，将萃取物加入柱层析硅胶进行吸附，干法上样，300目硅胶H进行柱层析分离，洗脱剂由乙酸乙酯和乙醚按体积比25∶1配制而成，收集组分进行TLC检测，目标组分浓缩，再进行2次柱层析分离，目标组分浓缩即得1α-羟基去氢表雄酮。1α-羟基去氢表雄酮为白色针状结晶。经Bruker Avance600型核磁共振波谱仪检测，结果如图2-图4所示。

上述生物转化培养基组分如下：蔗糖为5g/L，硝酸钠为5g/L，硫酸镁为2g/L，硫酸锰为0.01g/L，硫酸亚铁为0.01g/L。

所述的底物溶液通过如下步骤配制：

用β环糊精溶解去氢表雄酮，按每克去氢表雄酮溶解于20毫升β环糊精计。直接将称量好的底物去氢表雄酮加入一定量的溶剂中震荡或搅拌溶解。

经检测，生物转化率32.3％，产物提取得率78.1％，1α-羟基去氢表雄酮产品纯度为99.7％。

一株斜卧青霉及其培养方法与在转化甾体药物中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。