专利摘要

本发明提供了一种提高红树林内生真菌No.1403产抗癌蒽醌类化合物1403C产量的方法。通过添加丙二酸或乙酸钠和丙二酸混合物，红树林内生真菌No.1403的1403C发酵产量均有不同程度的提高，其中提高量最大的是乙酸钠和丙二酸按照1∶4的比例和6mM的终浓度进行添加，1403C对菌体得率最大为0.53g/g，比对照组产量0.26g/g提高了102.7％。本发明对于进一步进行1403C的抗癌药理药效实验具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于代谢调控领域，具体涉及一种提高红树林内生真菌No.1403产抗癌蒽醌类化合物1403C产量的方法。

背景技术

红树林内生真菌No.1403(Fusarium proliferatum)来自中国南海红树林树叶内部，由香港城市大学Vrijmoed教授等分离得到。中山大学林永成教授带领的研究组已从其发酵液中分离出20多种化合物，这些化合物大多具有抗肿瘤、抗菌活性(见夏雪奎，黄晓聪，张捷，梁智斌，谢丽娜，佘志刚，林永成，Vijmoed LLP.南海红树林真菌No.1403产生灰黄霉素的发酵条件初步优化，中山大学学报(自然科学版).2007，05：32-35)。

1403C(也称SZ-685C)是一种蒽醌类化合物，经中山大学黎孟枫教授等评定，该物质能明显抑制体外培养的多种肿瘤细胞系且对人体普通细胞毒副作用小(Xie GE，Zhu X，Li Q，Gu MH，He ZJ，Wu JH，Li J，Lin YC，Li MF，She ZG，Yuan J.SZ-685C，a marine anthraquinone，is a potent inducer of apoptosis withanticancer activity by suppression of the Akt/FOXO pathway.British Journal ofPharmacology.2010，159：689-697)。

然而在红树林内生真菌No.1403的摇瓶发酵中，1403C产量极低(约为1.3mg/L，见姜广策 林永成 周世宁等.中国南海红树林内生真菌No.1403次级代谢物研究[J].中山大学学报(自然科学)，2000，39(6)：68-72)，给进一步的体内外药理药效研究造成困难，急需研发一种提高红树林内生真菌No.1403产抗癌蒽醌类化合物1403C产量的方法。

发明内容

针对上述缺陷，本发明的目的是通过代谢调控提高红树林内生真菌No.1403的1403C产量，为新型、高效、低毒的抗肿瘤候选药物的开发奠定基础。

为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种提高红树林内生真菌No.1403产抗癌蒽醌类化合物1403C产量的方法，具体包括，在发酵培养基中添加一种促进剂，所述促进剂为丙二酸或乙酸钠和丙二酸的混合物。所述乙酸钠和丙二酸的混合物中乙酸钠和丙二酸的摩尔比为1∶1-1∶7。所述促进剂的初始添加时间在发酵24小时-48小时之间。所述促进剂的添加最终浓度为1.5-6mM。

其中，所述促进剂为丙二酸，所述促进剂的初始添加时间为发酵24小时，所述促进剂的添加最终浓度为3mM；

所述促进剂为乙酸钠和丙二酸的混合物，所述混合物中乙酸钠和丙二酸的摩尔比为1∶1或1∶4或1∶7，所述促进剂的初始添加时间为发酵24小时，所述促进剂的添加最终浓度为3mM；

本发明通过添加促进剂，使红树林内生真菌No.1403的1403C的产量获得不同程度的提高。其中，对照组1403C对菌体得率为0.26g/g，而根据本发明的方法1403C对菌体得率最大可提高到0.53g/g，比对照组提高了102.7％。根据本发明的方法可大大提高红树林内生真菌No.1403的1403C的产量，对1403C的进一步动物体内外药理药效研究具有重要的意义。

附图说明

图1是发酵24小时时添加不同终浓度的丙二酸对菌体生长及1403C合成的影响。

图2是发酵24小时时添加不同终浓度的乙酸钠和丙二酸混合物对菌体生长及1403C合成的影响。其中，乙酸钠和丙二酸摩尔比为1∶1。

图3是发酵24小时时添加不同终浓度的乙酸钠和丙二酸混合物对菌体生长及1403C合成的影响。其中，乙酸钠和丙二酸摩尔比为1∶4。

图4是发酵24小时时添加不同终浓度的乙酸钠和丙二酸混合物对菌体生长及1403C合成的影响。其中，乙酸钠和丙二酸摩尔比为1∶7。

图5是发酵36小时时添加不同终浓度的乙酸钠和丙二酸混合物对菌体生长及1403C合成的影响。其中，乙酸钠和丙二酸摩尔比为1∶4。

图6是发酵48小时时添加不同终浓度的乙酸钠和丙二酸混合物对菌体生长及1403C合成的影响。其中，乙酸钠和丙二酸摩尔比为1∶4。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

实验仪器与试剂

分析高效液相色谱Agilent 1100；色谱柱为C18柱(KromasilTM，Sweden，250×4.6mm×5μm， -spherical silica)购于天津特纳迪奥色谱技术有限公司。

HPLC级甲醇购于百灵威化学技术有限公司(Methanol，ACS/HPLC Certifie，J&K Chemical)；HPLC级纯水由密理博纯水系统(Millipore，Milli-Q Biocel)制备；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉购于英国Oxoid公司；乙酸钠、丙二酸(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司。

菌株

本发明所用的内生真菌1403保存在中国典型微生物保藏中心(CCTCC中国武汉大学)，编号为CCTCC M201018。菌种由中山大学林永成教授提供。

培养基

菌种保存用斜面培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH7；人工海水(ASW)1000mL：琼脂15-20g。

种子培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH7；人工海水(ASW)1000mL。

发酵培养基：葡萄糖10g；酵母粉1g；蛋白胨2g；pH7；人工海水(ASW)200mL；去离子水800mL。

培养方法

从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经121℃(0.1MP)高温灭菌25分钟的种子培养基，培养3天后接入同样经高温灭菌的发酵培养基，接种量5％(相对于培养基的体积百分比)。将装有50mL发酵培养基的250ml锥形瓶放在摇床上转速170r/min，培养温度28℃。培养时间96小时。

分析方法

(1)生物量的测定

采用干重法测定菌体生物量(DCW，Dry Cell Weight)。吸取15mL发酵液进行真空抽滤，再以去离子水洗涤过滤三次之后置于70℃恒温烘箱中烘干至恒重。

(2)1403C的粗提取

摇瓶发酵结束后，吸取10ml发酵液加入到装有20颗直径3mm玻璃珠的250ml锥形瓶中并与加入30ml乙酸乙酯进行过夜萃取，5000r/min离心后取上层有机相减压蒸馏浓缩后，溶于1.5ml甲醇。

(3)1403C的含量测定

用HP 1100液相色谱仪，Kramasil C18反相柱(250×4.6mm，5μm)，温度26℃，进样量15μl，检测波长为280nm，流速1ml/min，流动相为1％冰醋酸水溶液(A相)和甲醇(B相)，进行梯度洗脱，方法见表1。1403C含量根据色谱峰面积与标准品的峰面积对比以及浓缩倍数计算。

表1HPLC梯度洗脱

实施例1丙二酸对菌体生长及1403C合成的影响

向发酵液中添加不同浓度的丙二酸，初始添加时间为24小时，添加最终浓度分别为1.5mM，3mM，6mM

其结果如图1所示，丙二酸在发酵液中终浓度达到1.5、3、6mM时，菌体的生长相对于对照组没有明显影响，但是产物1403C对菌体得率相对于对照分别提高了3.8％、68.8％、59.2％，说明发酵24小时添加丙二酸对产物1403C生成有极大的刺激作用。

实施例2乙酸钠和丙二酸按照摩尔比为1∶1的比例混合后进行添加对菌体生长及1403C合成的影响

向发酵液中添加摩尔比为1∶1的乙酸钠和丙二酸的混合物，初始添加时间为24小时，混合物在发酵液中最终浓度分别为1.5mM，3mM，6mM

其结果如图2所示，乙酸钠和丙二酸的混合物在发酵液中终浓度达到1.5、3、6mM时，菌体干重分别为3.8、3.2、3.4g/L，比对照组的4.0g/L略低，但是1403C对菌体得率分别为0.35、0.43、0.33g/g DCW，比对照组的0.26g/g DCW提高量分别为32.7％、63.5％、26.9％，说明发酵24小时添加摩尔比为1∶1的乙酸钠和丙二酸对产物1403C生成有极大的刺激作用，其中，当摩尔比为1∶1的乙酸钠和丙二酸的终浓度为3mM时，其效果最好。

实施例3乙酸钠和丙二酸按照摩尔比为1∶4的比例混合后进行添加对菌体生长及1403C合成的影响

向发酵液中添加摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸的混合物，初始添加时间为24小时，添加最终浓度分别为1.5mM，3mM，6mM

其结果如图3所示，乙酸钠和丙二酸的混合物在发酵液中终浓度达到1.5、3、6mM时，菌体干重分别为3.6、4.3、3.1g/L，在对照组的4.0g/L上下浮动，但是1403C对菌体得率分别为0.41、0.40、0.53g/g DCW，比对照组的0.26g/gDCW提高量分别为57.3％、52.3％、102.7％，说明发酵24小时添加摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸对产物1403C生成有极大的刺激作用，其中，当摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸的终浓度为6mM时，其效果最好。

实施例4乙酸钠和丙二酸按照摩尔比为1∶7的比例混合后进行添加对菌体生长及1403C合成的影响

向发酵液中添加摩尔比为1∶7的乙酸钠和丙二酸的混合物，初始添加时间为24小时，添加最终浓度分别为1.5mM，3mM，6mM

其结果如图4所示，乙酸钠和丙二酸的混合物在发酵液中终浓度达到1.5、3、6mM时，菌体干重分别为3.8、3.4、3.5g/L，比对照组的4.0g/L略低，但是1403C对菌体得率分别为0.42、0.50、0.51g/g DCW，比对照组的0.26g/gDCW提高量分别为62.3％、90.8％、96.2％，说明发酵24小时添加摩尔比为1∶7的乙酸钠和丙二酸对产物1403C生成有极大的刺激作用，其中，当摩尔比为1∶7的乙酸钠和丙二酸的终浓度为6mM时，其效果最好。

实施例5乙酸钠和丙二酸按照摩尔比为1∶4的比例混合后进行添加对菌体生长及1403C合成的影响

向发酵液中添加摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸，初始添加时间为36小时，添加最终浓度分别为1.5mM，3mM，6mM

其结果如图5所示，乙酸钠和丙二酸的混合物在发酵液中终浓度达到1.5、3、6mM时，菌体干重分别为3.8、3.7、3.5g/L，比对照组的4.0g/L略低，但是1403C对菌体得率分别为0.37、0.41、0.35g/g DCW，比对照组的0.26g/g DCW提高量分别为42.3％、57.7％、34.6％，说明发酵36小时添加摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸对产物1403C生成有极大的刺激作用，其中，当摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸的终浓度为3mM时，其效果最好。

实施例6乙酸钠和丙二酸按照摩尔比为1∶4的比例混合后进行添加对菌体生长及1403C合成的影响

向发酵液中添加摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸的混合物，初始添加时间为48小时，添加最终浓度分别为1.5mM，3mM，6mM

其结果如图6所示，乙酸钠和丙二酸的混合物在发酵液中终浓度达到1.5、3、6mM时，菌体干重分别为3.8、4.0、3.5g/L，与对照组的4.0g/L相当，但是1403C对菌体得率分别为0.42、0.41、0.36g/g DCW，比对照组的0.26g/g DCW提高量分别为61.5％、57.7％、38.5％，说明发酵48小时添加摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸对产物1403C生成有极大的刺激作用，其中，当摩尔比为1∶4的乙酸钠和丙二酸的终浓度为1.5mM时，其效果最好。

其中，根据本发明的方法，促进剂的初始添加时间在此仅作为示例而非限制。通过上述实施例可知，当初始添加时间为24小时-48小时，产物1403C的产量获得不同程度的提高。

其中，根据本发明的方法的促进剂，乙酸钠和丙二酸的摩尔比在此仅作为示例而非限制。通过上述实施例可知，当两者的摩尔比为1∶1-1∶7，产物1403C的产量获得不同程度的提高。

其中，根据本发明的方法，其促进剂的最终浓度在此仅作为示例而非限制。通过上述实施例可知，当其最终浓度为1.5-6mM，产物1403C的产量获得不同程度的提高。

一种提高红树林内生真菌No.1403产抗癌蒽醌类化合物1403C产量的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。