专利摘要

本发明提供了一株能将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株B1，属于生物技术领域。该菌株分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，于2011年3月15日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.4665。该菌株能以难溶性磷酸盐为磷源，将其转化为可溶性的磷，能有效提高土壤中有效磷的含量。该菌株直接接种于土壤中，存活性较好，能显著提高土壤中有效磷的含量，该发明筛选出的菌株有生产成本低，使用方便，土壤存活性好的优点，适合在缺磷土壤中接种试验。本发明对于降低农业生产成本具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明提供一株能将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株B1，属于生物技术领域。是利用微生物的方法将红壤中难溶性磷酸盐转化为可供植物吸收的有效态磷，适用于普遍缺磷的红壤地区。

背景技术

磷是农业生态系统中的重要限制因子，提高土壤磷的有效性将具有战略性意义。土壤中存在大量溶磷细菌和溶磷真菌，对土壤难溶性磷酸盐溶解和有机磷矿化具有促进作用，无疑利用生物手段来提高土壤有效性是一重要途径。近年来由于水溶性磷肥的大量使用所引起的生态和环境问题日益突出，对解磷细菌的研究才突飞猛进地发展起来。随测试手段的发展，对于溶磷微生物已有大量研究，但大多数研究局限于菌株特性，而对环境因素特别是土壤条件对其影响研究很少，这也是阻碍溶磷微生物广泛应用的一个非常重要的因素，并且，在溶磷微生物的作用和效果的研究中，很少考虑微生物生物量磷的变化情况。

我国大多数耕地土壤全磷的80％以上为各种形态的无机磷酸盐。土壤中的磷酸盐几乎都是水不溶性的，对植物的有效性很低。加快土壤磷的转化是提高土壤磷利用效率的首要条件。由于酸性土壤中含有大量的铁、铝等金属离子，施入土壤中的水溶性磷肥很快被这些离子固定，丧失其有效性，从而降低了肥料的利用率。有报道称溶磷微生物的溶磷作用是低肥力土壤上促进植物生长最重要的机制之一。土壤中许多微生物能够溶解难溶态磷，促进植物对磷的吸收，增加作物产量和改善作物品质。但这些被分离出的微生物的溶磷作用并不稳定，它们的溶磷作用受环境条件的制约。

将解磷微生物作为生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地以及对培育和充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要的意义。由于不同种类的溶磷菌或不同菌株之间的溶磷能力和接种效果差异悬殊，所以高效解磷菌的筛选显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株能将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株B1。该菌株是筛选出的高效溶磷细菌，在土壤中接种该细菌能有效提高土壤中有效磷的含量，将红壤中难溶性磷酸盐转化为可供植物吸收的有效态磷。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株能将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株B1，菌株分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，于2011年3月15日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.4665。

该菌株B1经南京市金斯瑞生物科技有限公司测序，根据16S rDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16SrDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与B1的序列用MEGA version 3软件构建B1的16S rDNA系统进化树。根据B1的生理生化特征将其鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。其主要生物学特性为G^-(革兰氏染色反应阴性)，对数生长期菌体杆状，有芽孢，好氧生长。能以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下该菌株对磷酸铝的转化量比空白高出292.75mg·L^-1。

上述的能将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株B1在将土壤中难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的能将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株B1，在实验室摇瓶条件下该菌株对磷酸铝的转化量比空白高出292.75mg·L^-1。

将该菌株直接接种于土壤中，存活性较好，能显著提高土壤中有效磷的含量，最高时可比空白高出23.4mg·kg^-1。该发明筛选出的菌株有生产成本低，使用方便，土壤存活性好的优点，适合在缺磷土壤中接种试验。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低农业生产成本具有重要的意义。

附图说明

图1菌株B1菌落照片。

图2不同碳源对菌株溶磷效果的影响。

图3不同磷源对菌株溶磷效果的影响。

图4摇瓶培养4天后菌株的溶磷情况。

图5灭菌土培养14天后菌株的溶磷情况。

图6土壤原位培养14天后菌株的溶磷情况。

图7种植花生90天后菌株的溶磷情况。

图8空白处理和接菌处理的土壤种植花生的根瘤数量。

图9空白处理和接菌处理的土壤种植花生的百仁重和双荚果的比率。

图10空白处理和接菌处理的土壤种植花生的生长情况对比。

具体实施方式

1菌株的分离和鉴定

取江西进贤茶园土的土壤悬浊液，进行梯度稀释。稀释液涂布于改良后的PKO固体培养基上，30℃培养4天。从中挑取单菌落验证其溶磷效果，将溶磷圈较大、液体摇瓶培养溶磷效果较好的菌株保存，进行后续实验。其菌落图片见图1。

改良后的PKO固体培养基配方为：每升含磷酸铝4g，蔗糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.1g，七水合硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，酵母菌膏0.5g，琼脂20g，pH 7.0。

该菌株B1经南京市金斯瑞生物科技有限公司测序，根据16S rDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16SrDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与B1的序列用MEGA version 3软件构建B1的16S rDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；命名为：B1。主要生物学特性为G^-(革兰氏染色反应阴性)，对数生长期菌体为杆状，有芽孢，好氧生长。能以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下该菌株对磷酸铝的转化量比空白高出292.75mg·L^-1。

2实验室生物降解实验

2.1不同碳源对菌株溶磷效果的影响

将液体培养基(不加碳源、琼脂，其余同改良后PKO培养基配方)分装在三个100ml三角瓶中，每瓶分装25ml，每瓶分别加入0.3g磷酸铝，再取三角瓶分别加入0.25g葡萄糖、0.25g果糖和0.25g蔗糖。1×10⁵Pa条件下灭菌30min。将长于固体培养基上的菌株用接种环刮入无菌水中制成菌悬液，使浓度达到10⁸CFU·ml^-1，加1ml菌液于灭好菌并加入不同碳源的三角瓶中，置于恒温摇床(160r·min^-1，28℃)培养4d，采用样钼锑抗比色法测培养液有效磷含量，结果如图2。摇瓶培养4天后碳源为葡萄糖、果糖和蔗糖的培养基中的有效磷含量分别为94.5mg·L^-1、157.5mg·L^-1和292.7mg·L^-1，菌株在供给蔗糖时表现出了较好的溶磷活性。

2.2不同磷源对菌株溶磷效果的影响

将液体培养基(不加磷酸铝、琼脂，其余同改良后PKO培养基配方)分装在100ml三角瓶中，每瓶分装25ml，取4个装入液体培养基的三角瓶分别加入0.4g磷酸铁、0.4g磷酸铝、0.4g磷酸钙、0.4g磷矿粉。1×10⁵Pa条件下灭菌30min。接入菌株B1制成的菌液(10⁸CFU·ml^-1)1ml，置于恒温摇床(160r·min^-1，28℃)培养4d，采用钼锑抗比色法测培养液有效磷含量，结果如图3。摇瓶培养4天后磷源为磷酸铝、磷酸铁、磷酸钙、磷矿粉的培养基中的有效磷含量分别为292.7mg·L^-1、89mg·L^-1、26mg·L^-1、152mg·L^-1，菌株对于四种难溶的磷酸盐都表现出较好的溶磷能力，其中溶解磷酸铝的能力极为突出。

2.3摇瓶培养4天后菌株的溶磷效果

将液体PKO培养基(不加琼脂，其余同改良后PKO培养基配方)25ml分装在100ml三角瓶中，加入0.3g磷酸铝，1×10⁵Pa条件下灭菌30min，接入菌株B1制成的菌液(10⁸CFU·ml^-1)1ml，空白加等量无菌水，置于恒温摇床(160r·min^-1，28℃)培养4d，采用样钼锑抗比色法测培养液有效磷含量，结果如图4，菌株在液体培养条件下，它的有效溶磷量可达到292.7mg·L^-1。

2.4灭菌土培养14天后菌株的溶磷情况

红壤风干后过2mm筛，土壤湿度调节到50％的田间最大持水量，称100g土于150ml三角瓶中，1×10⁵Pa条件下灭菌30min，接入菌株B1制成的菌液(10⁸CFU·ml^-1)1ml，空白加等量无菌水，置于恒温培养箱(25℃)培养14天，土壤中有效磷含量测定使用钼锑抗比色法，结果如图5，在灭菌条件下，菌株的有效溶磷量可达3.2mg·kg^-1干土。

2.5土壤原位培养14天后菌株的溶磷情况

红壤风干后过2mm筛，土壤湿度调节到50％的田间最大持水量，称100g土于150ml三角瓶中，接入菌株B1制成的菌液(10⁸CFU·ml^-1)1ml，空白加等量无菌水，置于恒温培养箱(25℃)培养14天，土壤中有效磷含量采用钼锑抗比色法检测，结果如图6，在土壤原位培养条件下，菌株的有效溶磷量可达23.4mg·kg^-1干土。

2.6种植花生90天后菌株的溶磷情况

将8kg调好含水量的红壤装于大盆钵中，种植一颗花生，接入菌株B1制成的菌液(10⁸CFU·ml^-1)80ml，培养到花生下针期(90天)，土壤中有效磷含量采用钼锑抗比色法检测，结果如图7，在种植花生的条件下，菌株的有效溶磷量可达4.6mg·kg^-1干土。

3生产实施

将本发明的微生物溶磷菌B1接种于改良后的PKO固体培养基上，28℃培养至对数生长期，用接种环刮进无菌水里制成菌悬液，并使菌悬液浓度达到10⁸CFU·ml^-1。做一下两个处理：

接菌处理：将菌悬液均匀地喷施于土壤表层，接种量约为10ml·kg^-1土。在植物生长期间，视菌株的存活情况可适量补施菌悬液。

空白处理：作为对照，土壤不喷洒B1菌液。

用接菌处理和空白处理的土壤种植花生的盆栽实验

花生下针期，花生的空白和接菌处理的根瘤数量(如图8)分别为88个和127个。接种该溶磷菌能显著增加根系的根瘤数量，提高花生植株的固氮能力。

花生收获后(如图9)，空白和接菌处理的百仁重分别为43.1g和46.9g，双荚果的比率分别为0.84和0.89。接种该溶磷菌可提高花生的百仁重和双荚果的比率。如图10为花生收获后的果实照片对比。接菌处理后的土壤种植出来的花生其果实的大小和数量都高于空白处理的土壤中种植的花生。

能将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株B1专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。