IPC分类号 : C07K14/01,C12N15/34,C12N15/70,C12N1/21,G01N33/569,C12R1/19
专利摘要
一种重组猪圆环病毒2型Rep蛋白，其特征在于，所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.一种重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1、构建重组猪圆环病毒2型Rep蛋白基因克隆载体：设计巢式PCR引物对所采集的PCV2野毒感染猪病料进行DNA提取和巢式PCR扩增后构建成PCV2 Rep蛋白基因克隆载体； 步骤2、重组猪圆环病毒2型Rep蛋白基因改造：针对步骤1所得的巢式PCR扩增产物设计引物实现PCV2 Rep蛋白基因表达密码子的优化；且通过Over lapping PCR的方法，在PCV2 Rep蛋白基因表达序列的5’端增加编码His的序列，并封闭原序列中的NcoⅠ酶切位点； 步骤3、构建重组猪圆环病毒2型Rep蛋白表达质粒载体，所述表达载体表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示； 步骤4、构建重组猪圆环病毒2型Rep蛋白表达工程菌； 步骤5、重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的诱导表达及纯化。 3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中巢式PCR引物如下： PCV2 rep巢式PCR外套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示， PCV2 rep巢式PCR外套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， PCV2 rep巢式PCR内套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示， PCV2 rep巢式PCR内套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示； 所述步骤2中密码子优化所用的引物如下： 密码子优化上游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示； 密码子优化下游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。 4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中Over lapping PCR包括Over lapping PCR A片段和Over lapping PCR B片段， Over lapping PCR A片段的扩增模板为密码子优化后的扩增产物所构建的加载了PCV2 rep基因的pET28a表达质粒，所述A片段的扩增引物为： A片段的扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示； A片段的扩增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示； Over lapping PCR B片段的扩增模板为密码子优化后的扩增产物所构建的加载了PCV2 rep基因的pET28a表达质粒，所述B片段的扩增引物为： B片段的扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示； B片段的扩增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示； Over lapping PCR AB片段的扩增的模板是A片段扩增产物和B片段扩增产物，AB片段扩增引物为： AB片段扩增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示； AB片段扩增下游引物BP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。 5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中PCV2 Rep蛋白诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：8M尿素+0.05M pH7.4PBS；淋洗缓冲液：100mM咪唑+上样缓冲液；洗脱缓冲液：300mM咪唑+上样缓冲液。 6.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白表达载体，其特征在于，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。 7.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白表达工程菌，其特征在于，该工程菌包含权利要求6所述的猪圆环病毒2型Rep蛋白表达载体。 8.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白的抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒包括： (A)包被有权利要求1所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白的ELISA酶标板； (B)标准阴性血清：PCV2抗体阴性的猪血清； (C)标准阳性血清：PCV2抗体阴性的猪，用猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株接种后的血清； (D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗猪IgG或抗豚鼠IgG； (E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。 9.一种猪圆环病毒2型Rep蛋白的抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤： (1)制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白稀释后加到酶标板中吸附，空干包被洗液，加包被用封闭液封闭； (2)待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育； (3)酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗，抗猪IgG或抗豚鼠IgG加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干； (4)加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值。
重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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